微生物学教案

教案一第一章：绪论1、微生物及其共性——微生物的研究对象以及它们区别于其他生物的特征（微生物的共同特征）微生物：是肉眼看不清、微小生物的统称。其研究对象包括：病毒、古菌、细菌、真菌、许多单细胞藻类和原生动物。其中病毒属于非细胞类特殊类群，古菌和细菌属于原核生物、真菌、单细胞藻类和原生动物属于真核生物。微生物以其独特的共性特征而区别于其他生物，归纳为五大共性：（1）体积小，结构简单，表面积/体积比值大；（2）代谢活力强，吸收多，转化快；（3）生长旺，繁殖快；（4）分布广，种类多（多样性）；（5）适应性强，易变异。体积小、比表面积大特别有利于它们和周围环境进行物质、能量、信息的交换。微生物的其它很多属性都和这一特点密切相关。微生物的主要特征贯穿于基础微生物教学的各个章节中。2、微生物学(Microbiology)微生物学是研究微生物以及其独特的相关研究技术的科学。3、微生物的发现1676年，微生物学的先驱荷兰人列文虎克（Antonyvanleeuwenhoek）首次观察到了细菌。列文虎克的兴趣和爱好就是利用业余时间制造显微镜，并具有高超的使用技术。据说他曾制作过400多架单式显微镜和放大镜，放大率一般为50－200倍。4、微生物学的建立（巴斯德与柯赫对微生物学发展的重要作用与意义-奠基者）法国人巴斯德（LouisPasteur）（1822～1895）和德国人柯赫（RobertKoch）（1843～1910）被誉为微生物学的奠基人，是由于他们伟大的贡献。他们的工作为今天的微生物学奠定了科学原理和基本的方法。1)、巴斯德的主要贡献及意义：巴斯德开辟了微生物领域，并以倡导疾病细菌学说、发明预防接种方法而闻名，具体贡献为：(1)以著名的曲径瓶试验彻底否定了“自然发生”学说；巴斯德简单而完美的实验奠定了一种科学而理性的基础，表明微生物可以通过理性的科学的方法进行研究。自生说被否定的意义之一是：既然不是自生的，就必然已经存在，人们就可以去探索它，寻找它。由此将微生物的探索方法由一项科学性观察转向成了一项实验科学，打开了研究感染性疾病病因的方法之门。(2)在免疫学的预防接种方面，发现传染疾病的微菌，在特殊的培养之下可以减轻毒力，变成防病的药苗。首次制成狂犬疫苗；(3)发现并证实发酵是由微生物引起的；(4)其他贡献，如巴斯德消毒法等2)、柯赫的主要贡献及意义（1）对病原细菌的研究作出了突出的贡献：包括具体证实了炭疽杆菌是炭疽病的病原菌；发现了肺结核病的病原菌（1905年获诺贝尔奖）；提出了证明某种微生物是否为某种疾病病原体的基本原则——著名的柯赫原则，即①在每一相同病例中都出现这种微生物；②要从寄主分离出这样的微生物并在培养基中培养出来；③用这种微生物的纯培养接种健康而敏感的寄主，同样的疾病会重复发生；④从试验发病的寄主中能再度分离培养出这种微生物来。（2）微生物学基本操作技术方面的贡献包括：细菌纯培养方法的建立；设计了各种培养基，实现了在实验室内对各种微生物的培养；流动蒸汽灭菌；染色观察和显微摄影等技术。柯赫根据巴斯德的工作，证明了微生物是疾病的原因，并进一步表明：特定的疾病是由特定的微生物引起的。进一步将微生物研究推向更高的一种科学水平上，形成了疾病确定的“柯赫原则”。与此同时柯赫还向微生物学贡献了一系列研究技术。“柯赫原则”以及柯赫发明的纯培养技术，促进了微生物学的极大发展。5、微生物学的发展及贡献(1)多学科交叉促进微生物学全面发展，使微生物学发展成为生命科学领域内一门发展最快、影响最大、体现生命科学发展主流的前沿科学。(2)微生物学推动生命科学的发展。促进许多重大生命理论问题的突破；对生命科学研究技术的贡献，如细胞的人工培养、突变体筛选、DNA重组技术和遗传工程、微生物与“人类基因组计划”等。教案二第二章：纯培养技术和显微技术一、纯培养技术1、分离获得微生物的纯培养物是研究利用微生物的基础。获得纯培养物涉及的相关技术包括：无菌技术、微生物的分离与分离纯化技术和微生物培养和保藏技术。2、无菌技术：包括培养基和物品的各种灭菌技术和微生物各种接种过程的无菌操作技术等。重点在实验课中掌握相关的技术原理和操作规范，以牢固树立“无菌”的思想和概念。3、固体培养基分离纯培养物的基本方法和原理纯培养指的是只有一种微生物组成的细胞群体。自然环境中微生物是混杂在一起的，因此分离获得纯培养物的基本原理：首先采用方法将单个的细胞与其他细胞分离开，进而提供细胞合适的营养和条件，使其生长成为可见的群体。进行微生物的分散主要采用稀释的方法，而固体培养基由于能够使分散的细胞固着于一定的位置，与其他的细胞分离，从而生长成为一个单细胞来源的群体－即纯培养，而成为常用而简便的分离介质和营养介质。固体培养基分离纯培养物由于稀释方法的差异和接种平板的方式差异而分为以下几种方法：（1）划线平板法将合适的无菌培养基倒入无菌培养皿中，冷却后制备成平板，按以下方法划线：平板划线法中细胞的分离和稀释过程发生在接种环在固体平板表面上的划线和移动过程中，产生的单个细胞在培养基表面生长的后代就是纯培养物。（2）倾注平板法和涂布平板法这两种方法的共同点就是在将细胞接种到培养基之前，通过液体稀释的方法分散细胞，最常用的液体稀释方法为10倍系列稀释，参考下图：随着稀释程度的增大，单位体积中的微生物细胞数量减少，细胞得以分散。稀释倾注平板法的操作是：选择细胞得以分散的合适稀释度的菌悬液与灭完菌冷却到50-55°C的培养基混合均匀，一起倒入无菌培养皿中，冷却形成平板后，培养。稀释倾注平板法操作较麻烦。在进行微生物分离纯化时，该方法需要样品与热的培养基混合，因此对热敏感微生物的影响明显；该方法操作过程中，样品中的微生物有的分布于平板表面，有的则裹在培养基中，后者则会影响严格好氧微生物的生长；而且，对于同一种微生物，平板表面的菌落形态与培养基内的菌落形态会存在着明显的差别，影响菌落形态的判别。在进行微生物计数时，该方法细胞分散均匀，计数较准确。稀释涂布平板方法的操作是：首先将灭完菌冷却到50-55°C的培养基倒入无菌培养皿中冷却形成平板，然后选择细胞得以分散的合适稀释度的菌悬液加到平板中央，以三角刮刀将之均匀地涂布于整个平板上，培养。稀释涂布平板方法操作相对简单，它克服了倾注平板方法对热敏感微生物、严格好氧微生物和培养基内部菌落带来的不利影响，是实验室中经常使用的常规分离方法。其存在的问题是有时会由于菌液太多或者涂布不均匀而使细胞分散不充分，影响计数结果和分离纯化效果。（3）稀释摇管法主要用于厌氧微生物的分离纯化，是稀释平板法的一种变通。其基本操作流程为：试管培养基融化à50度保温à样品梯度稀释后加入试管培养基中à摇匀冷却凝固à石蜡油封闭à培养。细胞固着于试管的琼脂柱中，再加以石蜡覆盖，就可以进行厌氧菌的分离纯化。由于氧的存在对严格厌氧微生物有毒害作用，因此严格厌氧菌的培养往往需要专业的厌氧操作设备。因此，稀释摇管法在虽然观察和挑取菌落时比较困难，但是在缺乏专业设备的条件下，此法仍是一项方便有效地进行厌氧微生物分离、纯化和培养的低成本方法。所有以稀释为基础达到分离纯培养物的方法，其前提条件是该类群的微生物细胞必须在群体中占有数量上的优势，才能够在不断的稀释中不被淘汰而保留下来。4、液体培养基分离纯培养的原理液体培养基分离纯培养物仍然基于稀释的基本原理，但是需要高度稀释，致使一支试管中分配不到一个微生物细胞，至多只有一个细胞，这样才能够在液体培养基中获得纯培养物。因此根据统计学原理，采用稀释法进行液体分离纯培养物时，必须要求在同一个稀释度的许多平行试管中，大多数（一般应超过95%）试管中表现为不生长，这时表现为生长的试管中为纯培养的可能几率就增大（据统计计算，若同一稀释度的试管中有95%表现为不生长，在有细菌生长的试管中培养物来源于一个细胞（即纯培养）的几率为97.5%。来源于两个细胞的几率为2.44%，来源于三个细胞的几率为0.04%）5、选择培养分离与富集培养所有以稀释为基础达到分离纯培养物的方法，其前提条件是该类群的微生物细胞必须在群体中占有数量上的优势，才能够在不断的稀释中不被淘汰而保留下来。非数量优势微生物类群的分离纯化则可以首先通过选择培养与富集培养的方式使其数量增加，成为数量优势菌群后，再通过上述各种平板法进行分离和纯化。选择培养就是通过添加抑制剂，抑制大多数其它微生物的生长；或者选择特定的营养物，使得需要的微生物易于快速生长。——没有一种培养基或一种培养条件能够满足自然界中一切生物生长的要求，在一定程度上所有的培养基都是选择性的。富集培养就是利用不同微生物间生命活动特点的不同，制定特定的环境条件，使仅适应于该条件的微生物旺盛生长，从而使其在群落中的数量大大增加，人们能够更容易地从自然界中分离到所需的特定微生物。6、微生物的保藏技术性状稳定的菌种纯培养物是微生物学工作最重要的基本要求，否则生产或科研都无法正常进行。影响微生物菌种稳定性的因素：a）变异b）污染c）死亡基本要求：在一定时间内使菌种不死、不变、不乱。基本方法：生活态:培养基传代培养(斜面、平板、半固体);??寄主传代培养休眠态’?冷冻(液氮、低温冰箱);?干燥(沙土管、冷冻真空干燥)其它方法：滤纸片;明胶片;蒸馏水对于一些比较重要的微生物菌株，则要尽可能多的采用各种不同的手段进行保藏，以免因某种方法的失败而导致菌种的丧失。二、显微技术由于微生物微小，多数肉眼无法看见，因此对于微生物世界的认识必须借助于显微技术。显微技术不仅与显微镜自身的原理和特点有关，也取决于进行显微观察时对显微镜的正确使用及良好的标本制作和观察技术。因此显微技术是微生物学的重要内容之一，在了解各种显微工具及其原理和应用优势后，还必须紧密结合试验课程熟练掌握微生物学研究的常规显微工具。1、显微镜的分辨率显微镜物象是否清楚不仅决定于放大倍数，还与显微镜的分辨率（Resolution）有关，它是决定观察效果的最重要的指标。分辨率（力)（Resolution，R)指的是显微镜能够分辨两点之间最小距离能力。能够分辨的距离越小，分辨率越高，反之越低。依据德国理学家ErnstAbbe，在19世纪70年代建立的在Abbe的公式中，两物体之间的最小可分辨距离被称为最小距离（d）0.5λ最小可分辨距离：d=——————nsinθ公式解析：（l）所用光源的光波波长（λ），是影响最小可分辨距离的最主要因素。可见光光线的波长为400-700nm，，其中蓝光的波长最短（400-500nm），最小可分辨距离最小，所提供的分辨率最高（所以为什麽大多数显微镜的滤光片都是蓝色的）。（2）θ:为物镜镜口角的半数，它取决于物镜的直径和工作距离。（3）n：玻片（样品）与物镜间介质的折射率(空气：干燥物系；香柏油：油浸物系)。（4）nsinθ:被称为数值口径（NumericalAperture,NA)，它是决定物镜性能的最重要的指标。分辨率从定义上讲，与可分辨的最小距离（d）成反比，可表示为：Ｒμ（１／ｄ）。以这种方式将最小可分辨距离与分辨率作为两个概念分开理解，比较容易理解提高分辨率的相关措施（获得最小分辨距离à提高分辨率）：（1）减短光波波长（λ）。（2）增加镜口角(θ),这是增加数值口径的因素之一。（3）增加介质的折射率(n)，这是增加数值口径的重要因素。如，利用油镜进行显微观察时，以香柏油取代空气，其重要作用就是提高介质折射率，使数值口径和分辨率均得到提高，同时香柏油与玻璃的折射率相近，使得很多原来在透镜和载玻片表面因折射和反射而损失的光线可以进入物镜，提高照明亮度，改善观察效果。2、明视野显微镜明视野显微镜即常用的普通光学显微镜，其照明光线直接进入视野，属透射照明。生活的细菌在明视野显微镜下观察是透明的，不易看清。解决的措施，一方面是对观察的样品进行改造，发展出各种染色技术，通过特殊的染色方法使细胞着色，增加与背景的反差，便于观察；另一方面进行显微镜的改造，由此发展出不同种类的显微镜，适用于不同的观察目的。3、暗视野显微镜暗视野显微镜则利用特殊的聚光器遮挡中心光源，实现斜射照明，使