chapter4-1药物定量分析与分析方法验证

05:36:451第四章药物定量分析与分析方法验证⊙定量分析样品的前处理方法⊙定量分析方法的特点⊙药品分析方法的验证⊙生物样品分析方法的基本要求05:36:452一、定量分析样品前处理方法Pretreatmentofsampleusedinquantitativeanalysis化学原料药药物制剂含金属或含卤素、硫、磷、硒等特殊元素IIICOOHCH3COHNNHCOCH3泛影酸IIICH2CHCOOHNH2C2H5碘番酸BrBrBrBrHOOHOOSSOONaNaOOOO磺溴酞钠CH3CH3OHCCl3C12H2O三氯叔丁醇CH3HCICOOC2H5CH28碘苯酯含金属的有机药物OCCHCHCOOOOO-OOOSbSbO-CHOCCHCO2K+3H2OHCCOOCCHOOFe酒石酸锑钾富马酸亚铁OAsHOOHNHCONH2卡巴胂有机金属药物05:36:455定量分析样品前处理方法＊不经有机破坏的分析方法1、直接测定法－含金属或C-M不牢固的有机金属配位滴定法－乙二胺四乙酸二钠（EDTA）配位化合物，葡萄糖酸钙氧化还原滴定法－富马酸亚铁（硫酸铈，邻二氮菲）；葡萄糖酸锑钠（碘量法，硫代硫酸钠滴定液滴定）05:36:456定量分析样品前处理方法＊不经有机破坏的分析方法2、经水解后测定法－卤素联脂肪碳链（溶于适当溶剂再水解）直接回流后测定碱化回流后测定－三氯叔丁醇酸水解后测定－十一烯酸锌05:36:457定量分析样品前处理方法＊不经有机破坏的分析方法3、经氧化还原后测定法－卤素联芳环牢固（一般用于测碘）碱性还原后测定法－如泛影酸酸性还原后测定法－如碘番酸利用药物中可游离的金属离子的氧化性测定含量05:36:458＊经有机破坏的分析方法湿法破坏HNO3-HClO4HNO3-H2SO4H2SO4-MSO4金属以高价态存在定量分析样品前处理方法凯氏定氮法（kjeldahlnitrogendetermination）1883年待测物与硫酸在凯氏烧瓶共热，有机结构被氧化分解（消解或消化）成CO2和H2O，有机结合的氮变为无机氮，与过量的硫酸结合为硫酸氢铵及硫酸铵，经NaOH碱化后变为NH3随水蒸汽馏出，用硼酸溶液或定量的酸吸收后进行酸碱滴定。05:36:4592007出口美国宠物毒粮2008中国结石儿奶粉三聚氰胺，melamine（化學式：C3H6N6），俗稱蜜胺、蛋白精05:36:451005:36:4511凯氏定氮法（kjeldahlnitrogendetermination）仪器装置凯氏烧瓶：为30~50ml（半微量法）或500ml（常量法）硅玻璃或硼玻璃制成的硬质茄形烧瓶蒸馏装置（半微量法）：1000ml的圆底烧瓶（A）、安全瓶（B）、连有氮气球的蒸馏器（C）、漏斗（D）、直形冷凝管（E）、100ml锥形瓶（F）橡皮管夹（G、H）05:36:4512＊经有机破坏的分析方法干法破坏：无水碳酸钠或氧化镁，注意温度氧瓶燃烧法（oxygenflaskcombustionmethod）定量分析样品前处理方法05:36:4513空心A.燃烧瓶B.铂丝网C.D.盛固体样品滤纸及其折叠法E.F.G.称取液体样品方法7mm50mm30mm尾部7mm13mm20mm25mm356mm166mm滤纸滤纸AGFEDCB氧瓶燃烧装置及称样方法05:36:4514氧瓶燃烧法样品吸收液测定方法含氟有机药物H2OpH4.3HAc-NaAcBuffer茜素氟蓝分光光度法含氯有机药物NaOH溶液银量法汞量法分光法含溴有机药物H2O2-NaOH液或NaOH液-银量法分光法硫酸肼饱和液含碘有机药物NaOH液-银量法碘量法硫酸肼饱和液汞量法分光法05:36:4515碘苯酯含量测定取本品约20mg，精密称定，照氧瓶燃烧法进行有机破坏，用NaOHT.S.2ml与H2O10ml为吸收液，待吸收完全后，加溴-醋酸溶液10ml，密塞，振摇放置数分钟，加甲酸约1ml，用水洗涤瓶口，并通入空气流约3~5min，以除去剩余的溴蒸气，加KI2g，密塞，摇匀，用Na2S2O3液(0.02mol/L)滴定，至近终点时，加淀粉指示液，继续滴定至蓝色消失，并将滴定的结果用空白试验校正。每1ml的硫代硫酸钠液(0.02mol/L)相当于1.388mg的C19H29IO205:36:4516二、定量分析方法的特点容量分析法光谱分析法色谱分析法05:36:4517定量分析方法的特点1、容量分析法滴定法－化学计量点－指示剂准确，相对误差0.2％专属性较差T，滴定度，单位体积（VB＝1ml）的滴定液相当于被测药物的量WA＝mB××MA，量纲为mg/ml。直接滴定法、间接定量法05:36:4518定量分析方法的特点2、光谱分析法(1)紫外－可见分光光度法A＝lg＝ECL灵敏度高、准确度高、操作简单、应用广泛①对照品比较法、②吸收系数法、③计算分光光度法、④比色法(2)荧光分光光度法灵敏度高、易被干扰、线性范围窄05:36:4519定量分析方法的特点3、色谱分析法(1)HPLC内标法加校正因子测定供试品中主成分含量外标法测定供试品中主成分含量(2)GC内标法加校正因子测定供试品中主成分含量05:36:4520三、药品分析方法验证指导原则化学药物质量控制分析方法验证技术指导原则化学药物非临床药代动力学研究技术指导原则化学药物临床药代动力学研究技术指导原则药物制剂人体生物利用度和生物等效性试验指导原则药物稳定性试验指导原则缓释、控释制剂指导原则微囊、微球与脂质体制剂指导原则细菌内毒素检查法应用指导原则05:36:4521目的：证明所采用的分析方法适合于相应的检测要求效能指标：评价分析方法的尺度效能指标包括:精密度,准确度,检测限,定量限,选择性,线性与范围,耐用性药品分析方法验证05:36:4522药品分析方法验证1、准确度（accuracy）：测量值与真实值接近的程度表示:回收率测定方法：回收试验加样回收试验05:36:45232、精密度（precision）：定义:同一样品多次测量值之间相互接近的程度表示：标准偏差(SD),相对标准偏差(RSD)重复性:同一实验室,同一人多次测定的精密度中间精密度:同一实验室，不同人，不同仪器测定的精密度重现性:不同实验室，不同人测定的精密度药品分析方法验证05:36:45243、专属性（specificity）指有其他成分（杂质、降解物、辅料等）可能存在情况下采用的方法能准确测定出被测物的特性)。药品分析方法验证05:36:45254、检测限（limitofdetection，LOD）药物能被检出的最低浓度(µg/ml)测定:信噪比法(S:N=3:1)5、定量限（1imitofquantitation，LOQ）药物能被定量测出的最低浓度(µg/ml)测定:信噪比法(S:N=10:1)药品分析方法验证05:36:45266、线性与范围（linearityandrange）待测物浓度与响应值成线性关系的浓度范围线性关系：Y=a+bx（r=0.9999)线性程度：相关系数7、耐用性（robustness）测定条件稍有变动时，对测定结果的影响程度影响因素：被测溶液的稳定性，流动相的组成和pH，商品柱的品牌，柱温等YXab药品分析方法验证05:36:4527检验项目和验证内容项目内容鉴别杂质测定含量测定及溶出量测定定量限度准确度＋＋精密度－＋重复性＋＋中间精密度＋①＋①专属性②＋＋＋＋检测限－③＋－定量限＋－线性＋＋范围＋＋耐用性＋＋＋①已有重现性验证，不需验证中间精密度②如一种方法不够专属，可用其他分析方法予以补充③视具体情况予以验证05:36:4528四、生物样品分析的基本要求常用样品的种类、采集和贮藏生物样品分析前处理技术定量分析方法的验证05:36:4529生物样品分析的基本要求－常用样品的种类、采集和贮藏血样：血浆（plasma）、血清（serum）全血（wholeblood）唾液尿液：加入防腐剂05:36:4530生物样品分析的基本要求－生物样品分析的基本步骤前处理方法选择1、生物样品的类型：血样，除蛋白释放药物唾液，离心去除粘蛋白沉淀尿样，酸或酶水解使药物从缀合物中释放2、药物的结构及其性质3、测定方法05:36:4531生物样品分析的基本要求－生物样品分析的基本步骤1.药物从蛋白结合或缀合物中释出⑴蛋白变性：如应用三氯醋酸、HClO4、有机溶剂(乙醇、丙酮、乙腈)使蛋白沉淀⑵盐酸水解⑶酶消化法：最常使用蛋白水解酶中枯草菌溶素(一种细菌性蛋白分解酶，可在pH7.0~11.0使肽键降解)05:36:453205:36:4533定量分析方法的验证－－生物样品分析（一）特异性内源性物质不得干扰原药、代谢物（二）标准曲线r≥0.9900，至少5个浓度，不许外延当标准曲线范围较宽时，应考虑采用权重系数(1/C或1/C2)以避免偏差。（三）精密度和准确度RSD≤15％、20％相对回收率85~115％（80~120％）05:36:4534定量分析方法的验证－－生物样品分析（四）定量限（LLOQ、ULOQ）3~5倍t1/2，或1/10~1/20倍Cmax（五）样品稳定性室温、冻融、冰冻长期（六）提取回收率（绝对回收率）一般低于100％，须稳定（七）质控样品已知浓度样品均匀放入待测生物样品序列中，以确保定量测定的准确度05:36:4535沉淀法处理血浆样品测定兰索拉唑及其代谢物5’-羟基兰索拉唑和兰索拉唑砜的浓度A、lansoprazoleB、5’-hydroxylansoprazoleC、lansoprazolesulphoneABC05:36:4536沉淀法处理血浆样品0.5ml血浆样品+50lIS(2000ng/mlindapaminde），涡旋30s＋1.0ml乙腈取上清液20µl进样旋涡振荡1min离心10´(15000r/min)05:36:4537ChromatogramsofLansoprazoleanditsmetabolites(A)drug-freeplasmasample;(B)LLOQsamplespikedwithlansoprazole(tR=4.80min，C=2.0ng/ml),5’-hydroxylansoprazole(tR=3.60min，C=2.0ng/ml),lansoprazolesulphone(tR=4.49min，C=0.5ng/ml),andIS(indapamide,tR=3.76min，C=200ng/ml)05:36:4538ChromatogramsofLansoprazoleanditsmetabolitesavolunteerplasmasamplecontaininglansoprazole,5’-hydroxylansoprazole,lansoprazolesulphone05:36:4539RESULT:plasmaconcentration-timeprofilesThemeanplasmaconcentration-timeprofilesoflansoprazole,5’-hydroxylansoprazole,andlansoprazolesulphoneafterasingleoraldoseoflansoprazoleentericcapsules(30mg)in20volunteers.