WST6502019抗菌和抑菌效果评价方法

ICS11.080C50WS中华人民共和国卫生行业标准WS/T650—2019抗菌和抑菌效果评价方法EvalutingMethodforEfficacyofAntibacterialandBacteriostasis2019-01-30发布2019-07-01实施中华人民共和国国家卫生健康委员会发布WS/T650—2019I前言本标准按照GB/T1.1-2009的规定进行编写。本标准由江苏省疾病预防控制中心、中国疾病预防控制中心环境与健康相关产品安全所、山东省疾病预防控制中心、黑龙江省疾病预防控制中心负责起草。本标准主要起草人：徐燕、谈智、张流波、陈越英、吴晓松、林玲、孙启华、崔树玉、赵华伟、吴克、张文生、王裕荣、吴晓、沈瑾、李炎、孙巍、王玲、王嵬、王晓蕾、褚宏亮。WS/T650—20191抗菌和抑菌效果评价方法1范围本标准规定了抗菌和抑菌评价方法的选择原则和使用。本标准适用于具有抗菌和(或)抑菌功能产品的抗菌、抑菌效果的鉴定。2规范性引用文件下列文件对于本文件的应用是必不可少的。凡是注日期的引用文件，仅所注日期的版本适用于本文件。凡是不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改单）适用于本文件。GB15979一次性使用卫生用品卫生标准FZ/T73023抗菌针织品消毒技术规范（2002版）卫生部（卫法监发〔2002〕282号）3术语和定义下列术语和定义适用于本文件。3.1抗菌antibacterial采用化学或物理方法杀灭或妨碍细菌生长繁殖，可减少其数量以及活性的过程。3.2抑菌bacteriostasis采用化学或物理方法抑制或妨碍细菌生长繁殖及其活性的过程。3.3持续抗菌作用sustainedantibacterialaction具有抗菌作用的消毒产品涂于物体表面，持续7d以上仍具有杀灭或妨碍细菌生长繁殖作用。3.4中和剂neutralizer在杀灭微生物试验中，用以消除试验微生物与消毒剂的混悬液中，以及微生物表面上残留的消毒剂，使其失去对微生物抑制和杀灭作用的试剂。4评价方法的选择原则WS/T650—201924.1抗菌试验与抑菌试验区别抗菌试验：测定抗菌产品对细菌和真菌的抗菌作用，试验过程中需要用中和剂终止杀菌作用。抑菌试验：测定抑菌产品对细菌和真菌的抑菌作用，试验过程中不需要使用中和剂终止抑菌作用。4.2根据产品性能选择合适的评价方法4.2.1抑菌效果评价方法的选择原则抑菌类产品选择抑菌效果评价方法。液体抑菌产品选择悬液定量抑菌试验，膏体或半固体凝胶类、黏稠状抑菌产品选择载体浸泡定量抑菌试验，湿巾类或其他自身含有抑菌成分的产品选择载体抑菌试验，肥皂类固体抑菌产品选择抑菌环试验，含有可溶性抑菌成分的纺织品选择浸渍抑菌试验，含有持续抑菌作用的抑菌洗液选择滞留抑菌试验。4.2.2抗菌效果评价方法的选择原则抗菌类产品选择抗菌效果评价方法。液体抗菌产品选择悬液定量杀菌试验，凝胶状或膏状抗菌产品选择载体浸泡定量杀菌试验，湿巾类或其他自身含有抗菌成分的产品选择载体杀菌试验，含有可溶性抗菌成分的纺织品选择浸渍抗菌试验。含有不可溶抗菌成分的纺织品、无纺布、纤维等，经鉴别不含可溶性抗抑菌成分后，采用烧瓶振荡试验。含有不可溶抗菌成分的瓷砖、塑料、金属、涂料等，采用贴膜试验；对于涂于表面，干燥后具有持续抗菌作用的产品，进行持续抗菌试验。5评价方法5.1抑菌效果5.1.1悬液定量抑菌试验5.1.1.1适用范围适用于液体抑菌制剂如卫生洗液、抑菌喷雾剂等对微生物抑菌效果的测定。5.1.1.2试剂、培养基及器材5.1.1.2.1试验菌株金黄色葡萄球菌（ATCC6538）、大肠杆菌（8099）、白色念珠菌（ATCC10231）及根据抑菌剂特定用途所用的其他菌株。5.1.1.2.2试剂稀释液：0.03mol/L磷酸盐缓冲液（PBS）（pH7.2～7.4），培养基：金黄色葡萄球菌和大肠杆菌的培养使用营养琼脂培养基，白色念珠菌的培养使用沙氏琼脂培养基。5.1.1.2.3器材恒温水浴箱、计时器、Ⅱ级生物安全柜等。5.1.1.3试验步骤WS/T650—20193取试验菌24h新鲜斜面培养物用PBS洗下，用PBS稀释至约5.0×105CFU/mL～4.5×106CFU/mL菌悬液备用。取无菌试管，先加入5.0mL样品（根据使用说明书要求使用原液或稀释液），置20℃±1℃水浴中5min后，再加入0.1mL试验用菌悬液，迅速混匀并立即计时。待试验菌与样品相互作用至说明书的规定时间，分别吸取1.0mL试验菌与样品混合液接种2个平皿，倾注培养基。菌量无法计数时，以PBS做10倍系列稀释，选适宜稀释度分别吸取1.0mL接种2个平皿，做活菌培养计数。同时用PBS代替样品，进行平行试验，作为阳性对照。阳性对照回收菌落数在1.0×104CFU/mL～9.0×104CFU/mL之间。取同批次PBS、培养基作阴性对照。所有试验样本和对照样本均在36℃±1℃培养，细菌繁殖体培养48h观察最终结果；白色念珠菌培养72h观察最终结果。试验重复3次，计算抑菌率。5.1.1.4抑菌率计算%100010AAAX...................................(1)式中：X—抑菌率，%；A0—阳性对照组回收菌量，单位为CFU/mL；A1—试验组回收菌量，单位为CFU/mL。5.1.1.5结果判定抑菌率≥50%～90%，判有抑菌作用；抑菌率≥90%，判有较强抑菌作用。5.1.2载体浸泡定量抑菌试验5.1.2.1适用范围适用于膏体或半固体凝胶类、黏稠状抑菌产品对微生物抑菌效果的测定。5.1.2.2试剂、培养基及器材载体为10mm×10mm脱脂白平纹布片，脱脂方法依照《消毒技术规范》（2002版）进行，使用前压力蒸汽灭菌备用，电子天平（d=0.01g），其它同5.1.1.2。5.1.2.3操作步骤取试验菌24h新鲜斜面培养物用PBS洗下，用PBS稀释至约5.0×106CFU/mL～5.0×107CFU/mL制成菌悬液备用。用微量移液器滴染10μl菌悬液于灭菌载体上，36℃±1℃烘干或室温晾干备用。按5g/片的量称取样品于无菌平皿内，置20℃±1℃水浴5min，用无菌镊子取染菌载体，使载体完全浸没于样品中，立即计时。待染菌载体与样品相互作用至说明书的规定时间，分别取染菌载体加入5.0mLPBS试管中，混匀，振荡，将试验菌洗下，分别吸取1.0mL样液，按活菌培养计数方法测定存活菌数，每管样液接种2个平皿。如平板上生长的菌落数较多时，可用PBS进行10倍系列稀释后，再进行活菌培养计数。取10.0g与试验样品同质材料不含抑菌成分的对照样品浸泡2片染菌载体进行平行试验，作为阳性对照。阳性对照回收菌量为1.0×104CFU/片～9.0×104CFU/片。取同批次PBS、培养基作阴性对照。所有试验样本和对照样本均在36℃±1℃培养，细菌繁殖体培养48h观察结果；白色念珠菌培养72h观察结果。试验重复3次，计算抑菌率。5.1.2.4抑菌率计算WS/T650—20194%100010AAAX...................................(2)式中：X—抑菌率，%；A0—对照样品的平均菌落数，单位为CFU/片；A1—被试样品平均菌落数，单位为CFU/片。5.1.2.5结果判定抑菌率≥50%～90%，判有抑菌作用；抑菌率≥90%，判有较强抑菌作用。5.1.3载体抑菌试验5.1.3.1适用范围适用于含溶出性抑菌成分的湿巾、无纺布口罩、卫生巾、护垫、尿布等固体类抑菌产品对微生物抑菌效果的测定。5.1.3.2试剂、培养基及器材见5.1.1.2。5.1.3.3试验步骤取试验菌24h新鲜斜面培养物用PBS洗下，用PBS稀释至约105CFU/mL～106CFU/mL，制成菌悬液备用。用灭菌剪刀在无菌条件下将试验样品和对照样品分别剪成20mm×30mm样片备用。试验时滴加0.1mL菌悬液。对照样片染菌前需经压力蒸汽灭菌。取无菌平皿，用无菌镊子取2片试验样片，勿重叠，置20℃±1℃水浴5min，在每一样片上滴加0.1mL试验用菌悬液，立即计时。待试验菌与样片接触作用至说明书的规定时间，分别夹取染菌样片加于5.0mLPBS试管中，混匀。振荡洗脱，分别吸取1.0mL样液，按活菌培养计数方法测定存活菌数，每管样液接种2个平皿。如平板上生长的菌落数较多时，可10倍系列稀释后，再进行活菌培养计数。同时用与试验样品同质材料不含抑菌成分的对照样片2片代替试验样片进行试验，作为阳性对照，阳性对照回收菌量为1.0×104CFU/片～9.0×104CFU/片；取同批次PBS、培养基作阴性对照。所有试验样本和对照样本均在36℃±1℃培养，细菌繁殖体培养48h、白色念珠菌培养72h观察最终结果。试验重复3次，计算抑菌率。5.1.3.4抑菌率计算见式（2）。5.1.3.5结果判定抑菌率≥50%～90%，判有抑菌作用；抑菌率≥90%，判有较强抑菌作用。5.1.4抑菌环试验5.1.4.1适用范围适用于含溶出性抑菌物质，可制成直径为5mm片状物的固体抑菌产品的抑菌效果鉴定；也可用于鉴别抗抑菌样品中是否含有可溶性抑菌物质。WS/T650—201955.1.4.2试剂、培养基及器材游标卡尺，其它见5.1.1.25.1.4.3试验步骤将试验菌24h新鲜斜面培养物用PBS洗下，稀释至5.0×105CFU/mL～5.0×106CFU/mL备用。抑菌片的制备：溶出性固体抑菌产品，直接制成直径为5mm，厚度不超过4mm圆片（块），每4片为一组。阴性对照样片的制备：取同种材质不含抑菌成分的样本，制成与试验组大小相同的圆片（块）。用无菌棉拭子蘸取浓度为5.0×105CFU/mL～5.0×106CFU/mL试验菌悬液，在适宜的培养基平板表面均匀涂抹3次。每涂抹1次，平板应转动60°，最后将棉拭子绕平板边缘涂抹一周。盖好平皿，置室温干燥5min。每次试验贴放1个染菌平板，每个平板贴放4片试验样片，1片阴性对照样片，共5片。用无菌镊子取样片贴放于平板表面，阴性对照样片贴于平板中心位置，试验样片贴于四周，贴放好后，用无菌镊子轻压样片，使其紧贴于平板表面。各样片中心之间相距25mm以上，与平板的周缘相距15mm以上。盖好平板，置36℃±1℃培养16h～18h观察结果，试验重复3次。用游标卡尺测量抑菌环的直径（包括贴片）并记录，测量抑菌环时，应选均匀而完全无菌生长的抑菌环进行，测量其直径应以抑菌环外沿为界。5.1.4.4结果判定阴性对照样片应无抑菌环产生，试验样品抑菌环直径＞7mm者，判为有抑菌作用；抑菌环直径≤7mm者，判为无抑菌作用。3次重复试验（共12个样片）均有抑菌作用，则判为合格。5.1.5浸渍抑菌试验5.1.5.1适用范围适用于溶出性抑菌织物（如抑菌毛巾、口罩、内衣等）抑菌效果的测定。5.1.5.2试剂、培养基及器材5.1.5.2.1试验菌株见5.1.1.2.15.1.5.2.2试样在距试样布边10cm以上、离布端1m以上部位，剪取直径为5cm的圆形试样若干，取3份试样分别装于3个锥形瓶中，盖好瓶口备用（需用试样数量要根据纤维类别及织物织法而定，以能吸收1mL菌液且锥形瓶中不留残液为度）。另同法剪取与试样相同材质但不含抑菌剂对照织物若干，取2份分别装于2个锥形瓶中，盖好瓶口，121℃灭菌15min备用。5.1.5.2.3试剂和培养基0.03mol/LPBS（pH7.2～7.4），肉汤培养基、营养琼脂培养基、沙氏培养基。5.1.5.2.4菌悬液的制备WS/T650—20196用接种环将保存的菌种以划线法接种到营养琼脂平板，36℃±1℃培养24h，取典型的菌落移种到含肉汤培养基的锥形瓶中，36℃±1℃培养24h，用肉汤对培养液进行系列稀释，使菌悬液的含菌量为1.0×105CFU/mL～5.0×105CFU/mL。5.1.5.3试验步骤分别取1mL菌悬液加入2份准备好的锥形瓶内试样和1份对照织物上，确保其均匀分布，且锥形瓶中不留多余液，封好瓶口，以防蒸发造成细菌死亡。分别在一个盛有已接种菌悬液的试样和对照织物的锥形瓶