实验一-α-淀粉酶活力的测定

实验一α-淀粉酶活力的测定[实验性质]验证性实验[实验学时]2学时[实验目的](1)掌握淀粉酶糖化淀粉的原理；(2)掌握淀粉酶的性质及作用；(3)熟练α-淀粉酶活力测定方法。[实验原理]α-淀粉酶催化淀粉水解生成小分子可溶性糊精和少量的麦芽糖、葡萄糖，这些产物与碘反应呈现不同的颜色。通过呈色反应，可了解底物的降解速率，并以此可反映酶活力。[实验设计要求]1.按照给定的实验方法，以可溶性淀粉为实验材料测定α-淀粉酶活力大小。2.实验要设置3次重复。[实验材料与试药]1.实验材料可溶性淀粉、α-淀粉酶。2.主要试药结晶碘、碘化钾、磷酸氢二钠、柠檬酸、氯化钴、重铬酸钾、络黑T等。[仪器设备]电子天平、恒温水浴锅、温度计、酸度计、抽滤机等。[器皿及耗材]名称规格数量名称规格数量称量纸烧杯量筒滤纸玻璃棒洗涤瓶抽滤瓶瓷漏斗比色管试管试管架50mL100mL250mL50mL∮10cm250mL250mL∮10cm25mL100mL∮2.5cm若干2111251111111容量瓶试剂瓶移液管大肚移液管50mL100mL150mL250mL500mL1000mL500mL0.5mL1mL2mL5mL20mL11121221122[试剂配制](1)原碘液称取分析纯结晶碘llg，分析纯碘化钾22g。先用少量蒸馏水使碘化钾完全溶解，再溶解结晶碘，最后用蒸馏水定容至500mL，贮于棕色试剂瓶内暗藏。(2)稀碘液取原碘液2mL，加碘化钾20g，加蒸馏水溶解定容至500mL，贮于棕色试剂瓶内暗藏。(3)0.02mol/L磷酸氢二钠——柠檬酸缓冲溶液(pH6.0)称取磷酸氢二钠45.23g和柠檬酸8.07g，用蒸馏水溶解定容至1000mL，配好后应以酸度计校正pH值为6.0，置试剂瓶冷藏。(4)标准终点色溶液A液：称取分析纯氯化钴12.0732ｇ和分析纯重铬酸钾0.1463g，以蒸馏水溶解定容至150mL，置250mL试剂瓶暗藏。B液：称取络黑T8.0000mg，以蒸馏水溶解定容至100mL，置250mL试剂瓶暗藏。第一步：待测酶液的配制；第二步：标准色的配制；第三步：样品的酶解反应；第四步：计算。[实验步骤]1.待测酶液的制备A液B液2.标准色的配制3.样品测定步骤混合液缓冲液淀粉液60℃酶液酶液60℃,30min60℃,5min5mL20mL60℃30s60s90s120s180s210s0.5mL0.5mL碘液①②④⑤1.5mL2.0mL8.0mL1.0mL50mL1.000g250mL⑥150mLα-淀粉酶50mL溶解10mL可溶性淀粉2.0g煮沸冷却100mL2%淀粉液③⑦α-淀粉酶活力1g酶粉(或lmL酶液)在60℃、pH6.0条件下，以1h(60min)液化可溶性淀粉的克数(或毫克数)为1酶活力单位，即1IU，单位为可溶性淀粉量(g)/mL·min。60—酶活定义中反应时间为60min；T—反应时间（min）；20—可溶性淀粉的毫升数；2%—可溶性淀粉浓度；N—酶液稀释倍数；0.5—测定时所用的稀酶液量（ml）。酶活力单位（g/ml）=(60/T×20×2%×N)÷0.5[实验结果计算]重复数反应时间(min)酶活力(g/mL·min)ⅠⅡⅢ表1α-淀粉酶活力测定结果X1.结果要取平均值，并以标准差表示实验结果。2.要求实验过程中淀粉的颜色变化过程录像或颜色变化终点要照像，并多媒体型实验结果单独标注班级和小组名提交或图片型实验结果直接写入在实验报告书里。[实验结果处理要求]1.实验报告书的编写要参考教师提出的写作格式规范。即：题目、作者（包括同组成员）、单位（班级和组别）、中文摘要、中文关键词、英文摘要、英文关键词、前言、材料与方法、结果与讨论、结论、参考文献等顺序。2.报告书的篇幅要求2000字以上。3.参考文献必须5篇以上，并至少有一篇英文。4.提交时间限为每周一下午3点。先交到课代表，由课代表汇总之后按时送到任课老师办公室。5.领取的报告书要妥善保管，期末考试时作参考。[实验报告书书写要求]1.考核形式现场操作、提问、报告书的评价等。2.考核点（1）现场考核看操作的准确性和规范性。（2）提问的考核点注重分析问题和解决问题的能力。（3）报告书的考核点主要考察报告书的结构；实验结果的准确性；实验的创意性；参考文献的数量和质量等。[考核形式及方法][思考题]1.请说出你所选用的α-淀粉酶活力测定方法是基于何种实验原理。2.在α-淀粉酶活力测定过程中影响活力的因素有什么？在实验过程中你采取什么措施防止其影响？3.举例说明在实际工作中α-淀粉酶活力测定的必要性。4.在实验指导书上介绍的几种α-淀粉酶活力测定方法中为什么本实验采用Wohlgemuth改良法？它有何种优缺点？α-淀粉酶制剂的酶学特性及其应用概述：中温α-淀粉酶采用枯草芽孢杆菌(BacillusSubtilis)经深层发酵提炼而成。广泛应用于酒精、啤酒、味精、淀粉糖、发酵工业的液化以及纺织、印染退浆等。原理：能水解淀粉分子中的α-1.4葡萄糖苷键，任意切断成长短不一的短链糊精及少量的低分子糖类，直链淀粉和支链淀粉均以无规则的形式进行分解，从而使淀粉糊的粘度迅速下降，即“液化”作用，故又称液化酶。产品特性：1、热稳定性：在60℃以下较为稳定，最适温度60-70℃，可适用于最高达90℃的液化过程。2、PH稳定性：在PH6.0-7.0时较稳定，最适PH6.0，PH5.0以下失活严重。3、钙离子浓度对酶活力的影响：钙离子对酶活力的稳定性有提高作用，没有钙离子，酶活力完全丧失。应用方法：1、在饴糖、酶法味精上的应用淀粉浆浓度为16-17B，调PH至6.2-6.4，并加入0.2%氯化钙(按原料重量计算)，然后将淀粉酶加入淀粉浆中(每克原料用酶6-8个单位)，充分混合后，加热至85-90℃，液化30分钟左右。2、在啤酒生产上的应用使用大米、玉米为辅料时先磨粉通过40目以上筛孔，在糊化锅中调浆后加淀粉酶，加酶量在6个单位/克原料左右，在85-90℃液化30分钟。3、在纺织品退浆上的应用使用精制的液体淀粉酶作为退浆剂，适用于不耐高温的丝绸、化纤、棉毛织品的退浆工艺，加酶量在0.2%(2000u/g)左右，在水浴50-80℃20-40分钟。4、其它工业一般控制在加酶量在每克淀粉6-8个酶活力单位，钙离子浓度150ppm。储存：本品系生物活性物质，日光、温度、湿度要引起酶失活。应防止太阳直晒，宜放在低温干燥处。