散发性乳腺癌中+DNMT3a、3b+表达及其与+BRCA1基因启动子甲基化和蛋白表达的相关性

散发性乳腺癌中DNMT3a、3b表达及其与BRCA1基因启动子甲基化和蛋白表达的相关性王晓东，陈文捷，于兆进，孙明立，张晶，陈秋晨，吴慧哲，赵琳，魏敏杰ＴｈｅａｓｓｏｃｉａｔｉｏｎｏｆＤＮＭＴ3ａ，3ｂｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎｗｉｔｈｔｈｅｓｔａｔｅｏｆｐｒｏｍｏｔｅｒｍｅｔｈｙｌａｔｉｏｎｏｆＢＲＣＡ1ｇｅｎｅａｎｄＢＲＣＡ1ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎｉｎｓｐｏｒａｄｉｃｂｒｅａｓｔｃａｎｃｅｒWangXiaodong，ChenWenjie，YuZhaojin，SunMingli，ZhangJing，ChenQiuchen，WuHuizhe，ZhaoLin，WeiMinjieDepartmentofPharmacology，ThePharmaceuticalSchoolofChinaMedicalUniversity，LiaoningShenyang110013，China.【Abstract】Objective：ToinvestigatetheassociationofDNMT3a，3bexpressionwiththestateofpromotermethyla-tionofBRCA1geneandBRCA1expressioninthedevelopmentofsporadicbreastcancer.Methods：WedetectedDN-MT3a，3bexpressionin200sporadicbreastcancertissuesand25breastfibroadenomatissuesbyimmunohistochemis-try.UsingmethylationspecificPCR，wedetectedthestateofpromotermethylationofBRCA1genein108sporadicbreastcancerpatients.Results：Comparedtobreastfibroadenomatissues，DNMT3aexpressionwassignificantlyin-creased（P=0.037）inbreasttissues，butnotDNMT3b（P=0.478）.TherewaspromotermethylationofBRCA1geneinsporadicbreastcancerpatients.TheoverexpressionofDNMT3aandDNMT3bwassignificantlycorrelatedwiththeincreasedTNMstageofsporadicbreastcancerpatients（P=0.064，P=0.007）.DNMT3awaspositivelycorrelatedwiththestateofBRCA1genepromotermethylation（r=0.222，P=0.021）andnegativelycorrelatedwiththestateofBRCA1expression（r=-0.172，P=0.022）.BRCA1expressionwassignificantlycorrelatedwithOSorDFSofspo-radicbreastcancerpatients（P=0.025，P=0.027），therewasancorrelationofDNMT3aexpressionbetweenOSorDFSofsporadicbreastcancerpatientsinsomedegree（P=0.052，P=0.091）.Conclusion：DNMT3aandDNMT3boverexpressioniscorrelatedwiththeinvasion，metastasisandpoorprognosisofsporadicbreastcancer；DNMT3amayparticipateintheprogressofBRCA1expressiondown-regulatedregulatedbyBRCA1genepromotermethylation.TheinhibitionofDNMT3aandDNMT3bhaveadvantagesintheprogressofpreventionandtreatmentofsporadicbreastcancer.【Keywords】sporadicbreastcancer；DNAmethyltransferase（DNMTs）；BRCA1；survivalanalysisModernOncology2015，23（07）：0937-0942【摘要】目的：探讨DNMT3a、3b蛋白表达与散发性乳腺癌BRCA1基因启动子甲基化状态及蛋白表达的相关性。方法：收集乳腺肿瘤组织及相关临床资料。采用免疫组化法检测200例散发性乳腺癌与25例乳腺纤维腺瘤组织中DNMT3a、3b蛋白的表达情况。甲基化特异性PCR检测108例散发性乳腺癌中BRCA1基因启动子甲基化状态。结果：与乳腺纤维腺瘤相比，乳腺癌组织中DNMT3a表达水平显著增高（P=0.037），DN-MT3b表达水平增加不显著（P=0.478）。乳腺癌中BRCA1基因启动子存在甲基化。DNMT3a、3b过表达与乳腺癌病程晚期（TNMⅢ-Ⅳ期）显著相关（P=0.064，P=0.007）；DNMT3a与BRCA1基因甲基化正相关（r=0.222，P=0.021），与BRCA1蛋白负相关（r=-0.172，P=0.022）。BRCA1蛋白表达与乳腺癌患者OS和DFS显著相关（P=0.025，P=0.027），DNMT3a表达与散发性乳腺癌OS和DFS存在一定的相关性（P=0.052，P=0.091）。结论：DNMT3a、3b高表达与乳腺癌侵袭转移、病程进展、预后相关。DNMT3a可能参与催化BRCA1基因启动子甲基化导致BRCA1蛋白表达下调的过程。抑制DNMT3a、3b蛋白可能有利于散发性乳腺癌的预防和治疗。【关键词】散发性乳腺癌；DNA甲基转移酶；BRCA1；生存分析【收稿日期】2014-09-28【基金项目】辽宁省高校创新团队支持计划资助项目（编号：LT2014016）【作者单位】中国医科大学药学院药理学教研室，辽宁沈阳110013【作者简介】王晓东（1989-），男，甘肃静宁人，硕士在读，主要从事分子肿瘤药理学研究。E-mail：[e-mail]【通讯作者】魏敏杰（1963-），女，辽宁沈阳人，教授，博士生导师，主要从事分子肿瘤药理学研究。E-mail：[e-mail]·739·现代肿瘤医学2015年04月第23卷第7期MODERNONCOLOGY，Apr.2015，VOL.23，NO.07【中图分类号】R737.9【文献标识码】ADOI：10.3969/j.issn.1672-4992.2015.07.17【文章编号】1672-4992-（2015）07-0937-06乳腺癌发病率为女性恶性肿瘤的第一位，严重威胁着女性生活质量与生命安全［1］，目前，乳腺癌的治疗以及疗效的预测不仅仅依靠于组织学，肿瘤基因组特征在其治疗学选择中越来越有影响［2］。DNA甲基转移酶（DNAmethyltrans-ferase，DNMT）家族至少包括DNMT1、2、3a、3b和3L，研究表明，DNMT3a、3b蛋白参与DNA甲基化的从头甲基化过程［3-6］，并在诸多恶性肿瘤的发生发展过程中具有重要作用［7-12］。在国内乳腺癌研究的相关报道中，尚未见DN-MT3a、3b蛋白表达水平的检测及其与乳腺癌患者临床病理参数的相关性报道。乳腺癌易感基因1（breastcancersusceptibilitygene1，BRCA1）是1990年发现的抑癌基因，作为一种抑癌基因，与乳腺癌密切相关，乳腺癌中常见BRCA1表达下调［13-14］。国内尚未见乳腺癌患者DNMT3a、3b表达与BRCA1蛋白表达及基因启动子甲基化相关性的研究报道。本研究采用免疫组化法检测了200例散发性乳腺癌与25例乳腺纤维腺瘤组织中DNMT3a、3b蛋白的表达情况，并采用甲基化特异性PCR法检测了其中108例散发性乳腺癌中BRCA1基因启动子甲基化状态，分析了DNMT3a、3b蛋白的表达与乳腺癌患者临床病理参数以及BRCA1蛋白表达及基因启动子甲基化的相关性，并进一步分析DNMT3a、3b蛋白表达、BRCA1基因甲基化、BRCA1蛋白对散发性乳腺癌的影响，以探讨DNMT3a、3b蛋白表达水平在散发性乳腺癌中的临床意义。1材料与方法1.1标本来源在中国医科大学附属第一医院乳腺外科病房2003年至2013年间的散发性乳腺肿瘤患者群体中收集本研究所用组织样本，包括200例乳腺癌组织及25例乳腺纤维腺瘤组织。患者术前均未接受放疗或化疗，采用TNM分期系统进行临床分期，以WHO（WorldHealthOrganization）标准进行组织学判定。200例乳腺癌患者的生存资料如表1所示，导管癌180例，小叶癌15例，其它类型癌（黏液癌、髓样癌、筛状癌）5例。患者平均年龄为51.3岁（27-89岁），104例（55.6％）患者淋巴结发生转移，手术前免疫组化检测显示BRCA1蛋白的阳性表达率为63.3％（n=112）。1.2主要试剂兔抗人DNMT3a、3b多克隆抗体购自SantaCruzBiotech-nology（DNMT3a：sc-20703，DNMT3b：sc-130740），UltraSen-sitiveTMSP超敏浓缩试剂盒购自福州迈新生物技术开发有限公司（KIT-0100R），DAB显色试剂盒购自北京中杉金桥生物技术有限公司（LI-9032/9033）。1.3免疫组化染色多聚甲醛固定、石蜡包埋组织块切成4μm的石蜡切片，经二甲苯脱蜡，降梯度乙醇脱苯、水化，于柠檬酸盐缓冲液（pH6.0）中80kPa高压修复10分钟。切片经3％过氧化氢/甲醇处理，正常山羊血清封闭。切片滴加DNMT3a、3b多克隆抗体（DNMT3a1：200稀释，DNMT3b1：100稀释），4℃孵育过夜。次日于切片滴加生物素标记的二抗（1：200稀释）在37℃孵育30min，然后滴加链霉菌抗生物素蛋白-辣根过氧化酶（SP）复合物，37℃孵育30min。滴加新鲜配制的DAB（3，3-diaminobenzidine）溶液显色。同步操作阴性对照组，不同之处在于采用PBS液代替DNMT3a、3b抗体，其他步骤不变。表1患者的临床资料总结Tab.1PatientcharacteristicsFeaturesn（％）Age（years）200≤5099（49.5）﹥50101（50.5）Menopausestate*188Pre-menopause90（47.9）Post-menopause98（52.1）Tumortype200Ductal180（90.0）Lobular15（7.5）Others5（2.5）Tumorsize（cm）*189≤2.043（22.8）﹥2.0-5.0116（61.4）﹥5.030（15.9）TNMstage*185I-Ⅱ122（65.9）Ⅲ-Ⅳ63（34.1）Nodesmetastasis*187No83（44.4）Yes104（55.6）Histologicalgrade*119G125（21.0）G283（69.7）G311（9.2）BRCA1*177Negative65（36.7）Positive112（63.3）注：*：数据缺失。Note：*：Datamissing.DNMT蛋白细胞核表达视为阳性表达。由两位有经验的临床病理医生对染色结果进行盲法评价。结果评定采用Allredscore积分［15］，即肿瘤细胞阳性细胞百分比计分（阴性计为0分，﹤1％计为1分，1％-﹤10％计为2分，10％-﹤1/3计为3分，1/3-﹤2/3计为4分，≥2/3计为5分）与染色强度计分（无染色计为0分、弱阳性计为1分、中等强度计为2分、强