微滴式数字PCR培训及应用分享

1微滴式数字PCR培训及应用分享Bio-RadFAS罗艳2019-03-112•微滴式数字PCR技术–ddPCR原理–ddPCR技术特点•QX200ddPCR系统–QX200ddPCR系统–ddPCR实验操作流程•ddPCR相关应用及实验设计3•微滴式数字PCR技术–ddPCR原理–ddPCR技术特点•QX200ddPCR系统–QX200ddPCR系统–ddPCR实验操作流程•ddPCR相关应用及实验设计4PCR技术的发展历史RoutinePCR定性检测1st2nd3rdReal-timePCR相对定量DigitalPCR绝对定量5Real-TimePCR的基本原理实时检测：在普通PCR反应体系中加入荧光物质（染料或探针），然后实时记录PCR过程中与目标分子量相关的荧光信号强度定量原理：利用指数期Cq值与起始模板量对数值间的线性相关性，对DNA进行定量CqThresholdCq:Quantificationcycle7DropletdigitalPCR技术原理==============DNA==========PCR反应体系配制微滴化处理PositivereactionsNegativereactions微滴的荧光信号检测荧光物质8ddPCR绝对定量原理Sample4HighconcentrationSample2LowconcentrationSample1NOtargetsSample3MediumconcentrationPoissoncorrected38/143Poissoncorrected96/143Poissoncorrected6.2/143p=34/143p=70/143p=6/143p=0positive/143total9ddPCR实现精准定量和高度重复NatMethods.201310ddPCR实现痕量样品的检测11ddPCR不易受扩增效率的影响ClinChem,2013ddPCRoffersanadvantageoverqPCRwhendealingwithinhibition-pronesamples12微滴式数字PCR的特点和优势○:Negativereactions●:PositivereactionsSamplepartitionedintomanyreactionsFluorescentsignaldPCRreactionmixAssay/targetPCREndpointanalysis-DigitalreadoutThreshold101011011010+-0102030405无需标准曲线的绝对定量（DNA/mRNA/miRNA/LncRNA）提高对抑制物的耐受度（克服抑制物对定量结果的干扰）更高的检测灵敏度（提升高丰度野生型背景下的0.1%突变检出率）更高的数据精密度（能识别1.1倍以内的浓度变化）更好的数据重复性（对靶标核酸含量的连续监测、横向比较）KeyBenefitsofddPCR:13•微滴式数字PCR技术–ddPCR原理–ddPCR技术特点•QX200ddPCR系统–QX200ddPCR系统–ddPCR实验操作流程•ddPCR相关应用及实验设计14QX200TM微滴式数字PCR系统微滴分析仪微滴发生器ReagentsConsumablesAssays15微滴式数字PCR的操作流程16微滴制备将含样品的预混液和油加入微滴发生卡的指定位置，放入微滴发生器内。每次对8个样品进行微滴化处理，2min完成，每个样品可生成20,000个微滴。17微滴扩增普通PCR仪即可，无需实时检测荧光。18将PCR反应板直接放入微滴分析仪，自动对样品进行逐个分析，每个微滴逐个通过检测器，每小时可完成32个样品的检测。微滴检测19软件自动分析结果，无需计算简易操作流程&软件使用指南20ddPCR相关配套试剂耗材微滴发生油ddPCR预混液微滴发生卡及密封垫引物/探针/Assay96孔反应板及封膜微滴读取油21•微滴式数字PCR技术–ddPCR原理–ddPCR技术特点•QX200ddPCR系统–QX200ddPCR系统–ddPCR实验操作流程•ddPCR相关应用及实验设计22ddPCR应用广泛稀有突变检测环境监测微生物检测微小差异基因表达分析NGS测序文库质控无创产前检查拷贝数变异分析DNA残留检测/CRMCs质控标定23ddPCR的主要应用•绝对定量：标准物质的标定，没有标准品但需要定量检测的样品……•高灵敏度的检测：痕量样品，珍稀样品，突变检测，单细胞研究……•高精密度的检测：微小表达差异分析，拷贝数变异分析（CNV），动态监测……•复杂样品的检测：环境样品，土壤，水样……•NGS结果的验证，基因编辑检测……24标准物质的标定AnalBioChem,2014中国计量科学研究院25ddPCR用于HIVDNA的高灵敏检测Background出生时为HIV阳性，进行抗病毒治疗，29天后即无法通过常规检测手段检测到HIVSolution24,26月龄时，采用ddPCR技术对该名婴儿HIVDNA进行检测NEJM,2013AgeHIVDNAdetectedbyddPCRReplication-competentvirusdetected24months37copies/millionPBMCNo26months4copies/millionPBMCNo灵敏度高达0.0004%26ddPCR用于单细胞mRNA和Protein检测Highlights•DigitalPLAprotocolallowsultrasensitiveproteinquantificationfromsinglecells•CombinationwithdigitalPCRallowsjointsingle-cellproteinandmRNAmeasurements•AbsolutemRNAandproteinabundancesmeasuredjointlyfromsinglemammaliancells•JointmRNA-proteindatawasusedtobuildatwo-stepmodelofgeneexpression27ddPCR用于微小基因表达差异分析研究研究内容：发现埃及伊蚊的性别决定因子Nix基因，采用ddPCR确定基因的拷贝数及对其他基因表达的调控Science,201528ddPCR用于微小基因表达差异分析研究采用了PCR，FISH和ddPCR的方法对Nix基因在雌雄性中的拷贝数进行检测分析采用ddPCR方法，检测Nix基因敲除后雌性分化相关因子dsx和fru的表达水平Science,201529近年来，人们对抗生素的过度使用越来越关注，在这样的背景下，人们希望能有替代措施来避免或者减少抗生素的使用。本文评价了来源于椰子的低聚甘露糖(MOS)作为添加剂，在凡纳滨对虾养殖过程中对对虾的生长、抗Vibrioharveyi弧菌能力等方面的作用。通过微滴式数字PCR对免疫基因表达水平的分析，证明MOS可以通过调节凡纳滨对虾自身免疫力相关基因的表达，从而提高抗Vibrioharveyi弧菌的能力。ddPCR用于凡纳滨对虾免疫基因表达分析30ddPCR用于凡纳滨对虾免疫基因表达分析Fig.Overviewofexperimentalplantodetermineeffectsofcopramealmannooligosaccharide(MOS)supplementationonshrimpgrowthandimmuneperformance.31ddPCR检测miRNA更灵敏、准确NatMethods.201332双重ddPCR检测2种蓝藻AEM,2017qPCR与ddPCR相关性较好；qPCR线性范围更宽，耗时更短，成本更低，适合初筛；ddPCR重复性更好，更耐受PCR抑制物以及多重反应的竞争抑制，检测水华样本的准确度和精确度更高。33ddPCR检测eDNA预测种群状态ddPCR检测的重复性及准确度更高，CV值更小ddPCR对环境因子的耐受程度更高，在检测真实样本时性能优于qPCR34ddPCR在基因编辑事件中的应用StrategyformutantdetectionddPCRdetectsandquantifiesmutantallelefreqof0.02%ddPCRdetectedgeneeditingeventsaslowas0.02%frequency10-folddecreaseinactiveworktimeoverexistingmethods(screen11clonesinsteadof2,000!)Over20independentiPSCclonesisolatedtodateusingddPCR35ddPCR文献搜索工具=18051402436636ddPCR实验设计——金黄色葡萄球菌的检测JClinMicro,2017Initialtestingof104nasalswabsshowedthattheddPCRmethodhad100%agreementwiththestandardculturemethod,whilethenormalduplexqPCRmethodhadonlyabout87.5%agreement.Thesingle-bacteriumduplexddPCRassayisrapidandpowerfulformoreaccuratedetectionofMRSAdirectlyfromclinicalspecimens.中国科学院武汉病毒所37ddPCR实验设计JClinMicro,2017annealingtemperatureoptimizationOptimizingconditionsforbacterialysisEvaluationoftheduplexddPCRperformancePerformanceofduplexddPCRforspikingexperimentAssayvalidationduplexddPCRandqPCRcomparisonPrimers/probesdesignSampletest(nasalswabspecimens)38JClinMicro,2017ddPCR实验设计39JClinMicro,2017ddPCR实验设计40Thankyou!罗艳应用支持邮箱：[e-mail]