实验十一-蛋白质脱盐

实验十一蛋白质脱盐(透析和凝胶过滤)在蛋白质的研究中，经常要进行蛋白质脱盐，即将蛋白质同其它盐类小分子分离开。蛋白质脱盐的方法很多，各有优缺点。以下仅介绍常用的透析和凝胶过滤方法，可根据实验条件和要求选用。（一）蛋白质透析一.目的学习透析的基本原理和操作。二.原理蛋白质是大分子物质，不能透过透析膜而小分子物质可以自由透过。在分离提纯蛋白质的过程中，常利用透析的方法使蛋白质与其中夹杂的小分子物质分开。三.仪器、试剂、材料1.仪器烧杯；玻棒；离心机；离心管；冰箱；电炉。2.试剂1％氯化钡溶液；硫酸铵粉末；1mol/LEDTA；2%NaHCO3。3.材料透析管（宽约2.5cm，长12－15cm）或玻璃纸;皮筋；鸡蛋清溶液：将新鲜鸡蛋的蛋清与水按1：20混匀，然后用六层纱布过滤。四.操作方法1.透析管（前）处理：先将一适当大小和长度的透析管放在1mol/LEDTA溶液中，煮沸10分钟，再在2％NaHCO3溶液中煮沸10分钟，然后再在蒸馏水中煮沸10分钟即可。2.取5ml蛋白质溶液于离心管中，加4g硫酸铵粉末，搅拌使之溶解。然后在4℃下静置20分钟，出现絮状沉淀。3.离心：将上述絮状沉淀液以1000转/分的速度离心20分钟。4.装透析管：离心后倒掉上清夜，加5ml蒸馏水溶解沉淀物，然后小心倒入透析管中，扎紧上口。5.将装好的透析管放入盛有蒸馏水的烧杯中，进行透析，并不断搅拌。6.每隔适当时间（5－10分钟），用氯化钡滴入烧杯的蒸馏水中，观察是否有沉淀现象。五.结果处理记录并解释实验现象。六.注意事项1.硫酸铵盐一定要充分溶解，才能使蛋白质沉淀下来。七.思考题在透析袋处理过程中，EDTA和NaHCO3起何作用？（二）凝胶过滤一.目的学习凝胶过滤的基本操作技术，了解凝胶过滤脱盐的原理和应用。二.原理凝胶过滤的主要装置是填充有凝胶颗粒的层析柱。目前使用较多的凝胶有葡聚糖凝胶（Sephadex）、琼脂糖凝胶（Sepharose）和聚丙烯酰胺凝胶（Bio-gel-P）等。这些多聚高分子材料,通过适当浓度的交联剂作用即产生分子间横向的交联，形成具有一定孔径的网络结构。当用这类材料制成粒状凝胶颗粒后，颗粒内部就形成一种三维网状结构。这些凝胶材料是高度亲水的，在水溶液里吸水显著膨胀。实际工作中常用每克干胶吸水量（ml）的10倍（G值）表示凝胶的交联度，可根据被分离物质分子的大小和工作目的，选择适合的凝胶型号。当在柱顶加上分子大小不同的混合物并用洗脱液洗脱时，自由通透的小分子可以进入胶粒内部，而受排阻的大分子不能进入胶粒内部。二者在洗脱过程中走过的路程差别较大，大分子只能沿着胶粒之间的间隙向下流动，所经路程短，最先流出。而渗入胶粒内部的小分子受迷宫效应影响，要经过层层扩散向下流动，所经路程长，最后流出。通透性居中的分子则后于大分子而先于小分子流出。从而按由大到小的顺序实现大小分子分离。凝胶过滤的操作条件温和，适于分离不稳定的化合物；凝胶颗粒不带电荷，不与被分离物质发生反应，因而溶质回收率接近100％，而且设备简单、分离效果好、重现性好，凝胶柱可反复使用，所以广泛使用于蛋白质等大分子的分离纯化、分子量测定、浓缩、脱盐等用途。本实验利用凝胶过滤的特点，将(NH4)2SO4盐同蛋白质分子分离开。三.仪器、试剂、材料1.仪器层析柱（ф2cm×15cm）;真空泵；真空干燥器；恒流泵；核酸蛋白检测仪；部分收集器；记录仪。2.试剂1％氯化钡溶液；硫酸铵粉末；SephadexG-25。3.材料鸡蛋清溶液：将新鲜鸡蛋的蛋清与水按1：20混匀，然后用六层纱布过滤。四.操作方法1.凝胶溶胀：取5gSephadexG-25,加200ml蒸馏水充分溶胀（在室温下约需6小时或在沸水浴中溶胀5小时）。待溶胀平衡后，用倾泻法除去细小颗粒，在加入与凝胶等体积的蒸馏水，在真空干燥器中减压除气，准备装柱。2.装柱：将层析柱垂直固定，旋紧柱下端的螺旋夹，加入1/4柱长的蒸馏水。把处理好的凝胶连同适当体积的蒸馏水用玻棒搅匀，然后边搅拌边倒入柱中，同时开启螺旋夹控制一定流量。最好一次连续装完所需的凝胶，若分次装入，需用玻棒轻轻搅动柱床上层凝胶，以免出现界面影响分离效果。最后放入略小于层析柱内径的滤纸片保护凝胶床面。3.平衡：继续用蒸馏水洗脱，调整流量使胶床表面保持2cm液层，平衡20分钟。4.样品制备：取5ml蛋白质溶液于离心管中，加4g硫酸铵粉末，搅拌使之溶解。然后在4℃下静置20分钟，出现絮状沉淀。将上述絮状沉淀液以1000转/分的速度离心20分钟，离心后倒掉上清夜，加5ml蒸馏水溶解沉淀物，即为样品。5.上样：当胶床表面仅留约1mm液层时，吸取1ml样品，小心地注入层析柱胶床面中央，慢慢打开螺旋夹，待大部分样品进入胶床、床面上仅有1mm液层时，用乳头滴管加入少量蒸馏水，使剩余样品进入胶床，然后用滴管小心加入3－5cm高的洗脱液。6.洗脱：继续用蒸馏水洗脱，调整流速，使上下流速同步。用核酸蛋白检测仪检测，同时用部分收集器收集洗脱液。合并与峰值相对应的试管中的洗脱液，即为脱盐后的蛋白质溶液。7.用氯化钡溶液检测蛋白质溶液，评价脱盐效果。五.结果处理记录并解释实验现象，讨论凝胶过滤的脱盐效果。六.注意事项1.整个操作过程中凝胶必须处于溶液中，不得暴露于空气，否则将出现气泡和断层，应当重新装柱。2.加样时应小心注入床面中央，注意切勿冲动胶床。七.思考题影响凝胶过滤脱盐效果的因素有那些？