DNA生物合成过程

第三节DNA生物合成过程DNA合成期MG2G1S哺乳动物的细胞周期一、复制的起始几个相关概念：1.复制起始点(origin,ori)原核生物只有一个复制起始点；真核生物染色体DNA有多个复制起始点，同时形成多个复制单位，两个起始点之间的DNA片段称为复制子(replicon)。2.复制叉(replicationfork)复制时双链打开，分开成两股，新链沿着张开的模板生成，复制中形成的这种Y字形的结构称为复制叉。3'5'5'3'5'3'5'3'复制方向3.双向复制(bidirectionalreplication)原核生物的复制是从一个起始点开始，同时向两个方向进行，称为双向复制。复制中的DNA成为状。DNA复制的起始就是要解开双链和生成引物。(一)DNA解成单链由拓扑异构酶松弛超螺旋，解螺旋酶解开双链，SSB结合到单链上使其稳定。复制起始的解链需要多种蛋白质参与。这些蛋白质与复制起始点的特有序列结合，促使其邻近的DNA解链。(二)引物合成引发体引导引物酶到达适当的位置合成引物。DnaADnaBDnaCDNA拓异构酶5'3'3'5'DnaADnaB、DnaCDNA拓扑异构酶SSB3535引发体和引物含有解螺旋酶、DnaC蛋白、引物酶和DNA复制起始区域的复合结构称为引发体。3535引物是由引物酶催化合成的短链RNA分子。引物引物长度约为十几个到几十个核苷酸不等。引物的合成方向也是5´→3´方向。DNA的聚合就是在引物的3´－OH上进行的。二、复制的延长在DNA聚合酶催化下，以解开的单链为模板，以四种dNTP为原料，进行聚合作用。即新进入的dNTP与引物3´－OH形成磷酸二酯键，由5´3´方向延长子链。5'3'5'dATPdGTPdTTPdCTPdTTPdGTPdATPdCTPOH3'3'DNA-pol目录模板方向3`→5`合成需要引物提供3`-OH合成方向5`→3`底物是dNTP5'3'5'DNA-polIIIdCTPdTTPdGTPdATPdTTPdCTPdATPdGTP(一)半不连续复制领头链(leadingstrand)顺着解链方向生成的子链，其复制是连续进行的，得到一条连续的子链。5'3'3'5'5'解链方向3'领头链的合成目录随从链(laggingstrand)复制方向与解链方向相反，须等解开足够长度的模板链才能继续复制，得到的子链由不连续的片段所组成。5'3'3'5'5'解链方向3'3'5'5'3'冈崎片段：•1968年日本生化学者冈崎用电镜及放射自显影技术，观察到DNA复制中出现一些不连续的片段，因而将这些不连续的片段称为冈崎片段。•原核生物的冈崎片段为一至二千个核苷酸，真核生物约为数百个核苷酸。随从链的合成目录(二)滚环复制(rollingcirclereplication)一些简单低等生物或染色体以外的DNA复制的特殊形式。5'3'5'3'5'3'三、复制的终止1.随从链不连续片段的连接2.原核生物在复制终止点的汇合3.真核生物端粒的合成(一)不连续片段的连接3'5'5'3'RNA酶POH3'5'5'3'DNA聚合酶P3'5'5'3'dNTPDNA连接酶3'5'5'3'ATP(二)原核生物复制的终止原核生物环状DNA为双向复制，复制片段在复制的终止点汇合。每个方向的领头链和相反方向的随从链的连接与不连续片段的连接相同。原核生物基因是环状DNA，双向复制的复制片段在复制的终止点(ter)处汇合。(三)真核生物复制的终止染色体DNA呈线性，复制在末端停止。3'5'5'3'3'5'5'3'不连续片段的连接3'5'5'3'3'5'5'3'哺乳动物的细胞周期DNA合成期G1G2SM二、真核生物的DNA生物合成•细胞能否分裂，决定于进入S期及M期这两个关键点。G1→S及G2→M的调节，与蛋白激酶活性有关。•蛋白激酶通过磷酸化激活或抑制各种复制因子而实施调控作用。•真核生物每个染色体有多个起始点，是多复制子复制。复制有时序性，即复制子以分组方式激活而不是同步起动。•复制的起始需要DNA-polα（引物酶活性）和polδ（解螺旋酶活性）参与。还需拓扑酶和复制因子(replicationfactor,RF)。Polα合成RNA引物后继续合成短的DNA（一）复制的起始•增殖细胞核抗原(proliferationcellnuclearantigen,PCNA)在复制起始和延长中起关键作用。三聚体中空管，为滑卡复制因子C（replicationfactorC,RF-C）由5种亚基组成，有ATP的结合位点，是PCNA的装卡器复制因子A（replicationfactorA,RF-A)是单链DNA结合蛋白ARS3553领头链3535亲代DNA随从链引物核小体（二）复制的延长•染色体DNA呈线状，复制在末端停止。•复制中岡崎片段的连接，复制子之间的连接。•染色体两端DNA子链上最后复制的RNA引物，去除后留下空隙。（三）复制的终止5’3’oriorioriori5’3’5’5’3’3’5’5’3’复制子3’复制子端粒(telomere)真核生物染色体线性DNA分子末端的结构。•结构特点：1.由末端单链DNA序列和蛋白质构成2.末端DNA序列是多次重复的富含G、C碱基的短序列•功能：1.维持染色体的稳定性2.维持DNA复制的完整性端粒酶(telomerase)•特点：1.由RNA和蛋白质构成的复合物2.为特殊的逆转录酶，能以自身的RNA为模板逆转录合成端粒DNA•功能：合成端粒DNA，维持端粒的长度爬行模型：端粒及端粒酶的意义：端粒的长短及端粒酶活性变化与细胞水平的老化(aging)及肿瘤的发生有一定关系。（五）真核生物DNA复制特点1.复制速度慢真核生物基因组复制先要解开核小体，复制叉前进的速度慢。真核生物基因组复制速度大约每秒钟50个核苷酸，仅为原核生物的十分之一。2.多起点复制真核生物的每条染色体上都有多个复制起点，这些复制起点可同时或先后发动复制。真核生物的复制叉行进速度虽慢，但由于复制的起点多，复制子小，整个DNA复制的速度还是快速的。3.引物及岗崎片段的长度均小于原核生物动物细胞中引物长度约10个核苷酸，岗崎片段长约100-200个核苷酸。真核生物岗崎片段的长度可能和核小体的结构有关。引物中混有DNA4.组蛋白合成与DNA复制同步组蛋白的合成也在细胞的S期，与DNA复制同步进行。组蛋白和DNA组装成核小体。5.真核生物染色体全部复制完成以前不会发动新一轮复制。复制的基本规律BasicRulesofDNAReplication第三节•半保留复制(semi-conservativereplication)•双向复制(bidirectionalreplication)•半不连续复制(semi-discontinuousreplication)•条件：DNA模板3`→5`RNA引物提供3`-OHdNTP底物DNA聚合方向5→3`•复制的高保真性(highfidelity)1.遵守严格的碱基配对规律；2.聚合酶在复制延长时对碱基的选择功能；3.复制出错时DNA-pol的及时校读功能。DNA复制的保真性至少要依赖三种机制DNA-pol的核酸外切酶活性和及时校读A：DNA-pol的外切酶活性切除错配碱基；并用其聚合活性掺入正确配对的底物。B：碱基配对正确，DNA-pol不表现活性。逆转录和其他复制方式ReverseTranscriptionandOtherDNAReplicationWays第四节逆转录酶(reversetranscriptase)逆转录(reversetranscription)逆转录酶一、逆转录病毒和逆转录酶逆转录病毒细胞内的逆转录现象RNA模板逆转录酶DNA-RNA杂化双链RNA酶单链DNA逆转录酶双链DNA逆转录酶AAAATTTTAAAASI核酸酶DNA聚合酶Ⅰ碱水解TTTT分子生物学研究可应用逆转录酶，作为获取基因工程目的基因的重要方法之一，此法称为cDNA法。以mRNA为模板，经逆转录合成的与mRNA碱基序列互补的DNA链。试管内合成cDNAcDNAcomplementaryDNA二、逆转录研究的意义•逆转录酶和逆转录现象，是分子生物学研究中的重大发现。•逆转录现象说明：至少在某些生物，RNA同样兼有遗传信息传代与表达功能。•对逆转录病毒的研究，拓宽了20世纪初已注意到的病毒致癌理论。•滚环复制(rollingcirclereplication)三、滚环复制和D环复制是某些低等生物的复制形式，如X174和M13噬菌体等。3-OH5-P55533335'滚环复制5'5335目录dNTPDNA-polγ•D环复制(D-loopreplication)是线粒体DNA(mitochondrialDNA，mtDNA)的复制形式。