HPLC法定量分析水中光合细菌菌体产量

HPLC法定量分析水中光合细菌菌体产量摘要:为了定量分析水中光合细菌(PSB)菌体产量，为光合细菌污水资源化提供方法依据，采用HPLC法分析CoQ10的质量，进而测得水中PSB的菌体产量．实验结果表明，色谱条件为:色谱柱为SphherisorbC18(10cm×4.6mmID)柱;甲醇与无水乙醇为流动相，体积比9∶1;流速为1mL/min;柱温35℃;紫外检测波长275nm;进样量15μL;柱压16.4MPa．先用丙酮提取5h后挥掉全部丙酮，再用无水乙醇溶解，这一提取方法对CoQ10的相对提取率最高．加外标检测法平均回收率为99.13%，相对标准偏差为0.81%(n=5)．不同培养条件及生长时期的PSB内CoQ10的含量十分稳定．废水中杂质、杂菌等干扰因素均不影响CoQ10的检测结果．PSB质量浓度为(Y+37.487)/25.431g/L，其中Y为峰面积(V·s)．该方法简便易行，结果准确，可用于水中PSB菌体含量的定量分析．关键词:HPLC;PSB;CoQ10;菌体产量;污水资源化HPLCquantificationofphotosyntheticbacteriainwaterAbstract:Totestbiomassofphotosyntheticbacteria(PSB)inwater，andtoprovideawayofPSBsewagereclamation，thispaperadoptedHPLCtoanalyzetheconcentrationofCoQ10andthusobtainedtheconcentra-tionofPSBinwater．Theresultsshowthatthechromatographicconditionisasfollows:ThechromatographiccolumnisSphherisorbC18(10cm×4.6mmID);methanol-absolutealcohol(9∶1)asmobilephaseataflowrateof1mL/min;columntemperature35℃;WaveLengthofUVdetector275nm;samplesize15μL;col-umnpressure16.4MPa．Byextracting5hwithacetone，volatilizingacetonecompletelyanddissolvingitwithabsolutealcohol，thismethodmayobtainthemaximumrelativeextractionofCoQ10．Theaveragerecoveryratioofexternalreferencemethodis99.13%andRSD0.81%．Thehighestradiance-extractionisacetoneextrac-tion5hbeforeevaporatingcompletelyandthensolvinginethanol．TheconcentrationofCoQ10inPSBinvari-ousculturalconditionsandgrowingphasesisquitestable．Theimpuritiesormicrobesinwastewaterdonotaf-fectthetestingresult．TheconcentrationofPSBis(Y+37.487)/25.431g·L－1，Yispeakarea(V·s)．Thismethodissimpleandaccurate，andcanbeusedforquantitativeanalysisofPSBinwater．Keywords:HPLC;PSB;CoQ10;biomass;sewagereclamation收稿日期:2010－09－26．基金项目:国家自然科学基金重点项目(50978072)．作者简介:赵微(1982—)，女，博士研究生;张光明(1973—)，女，教授，博士生导师．光合细菌(Photosyntheticbacteria，PSB)是一类以光作为能源、能在光照厌氧或黑暗好氧条件下利用有机物、硫化物、氨等作为供氢体兼碳源进行光合作用的微生物．PSB能有效处理高浓度有机废水［1］，对淀粉、豆制品加工［2］、啤酒厂［3］、油脂工业等工业废水及生活污水，处理效果好，对COD的去除率达到60%～95%，且PSB菌体本身含有丰富的营养物质和生理活性物质［4］，能够作为肥料、饲料、饵料［5］回收利用，在处理废水的同时可实现污水资源化．然而，由于废水中各种干扰物质的存在，使得废水中PSB菌体产量的准确测量存在问题．在纯培养条件下PSB的定量检测方法包括显微镜直接计数法、平板计数法、紫外分光光度法与可见分光光度法、HPLC法等．显微镜直接计数法随机性大，不能宏观、全面地反应菌体数量，在废水处理中一般不采用该方法．平板计数法计数周期长、方法复杂，在废水处理中一般也不采用该方法．紫外分光光度法与可见分光光度法受废水中杂质影响较大，尤其是受色度的影响，因此这2种方法不适合检测带有浊度或色度的废水．HPLC法虽然方法简便易行、精确、不受废水中杂质影响，但不能将PSB作为直接检测物来分析．吴祖芳等的研究［6］表明，PSB中含有一种特征物质CoQ10［7］(CoQ10又称泛醌，化学名称为2，3－二甲氧基－5－甲基－6－癸异戊烯基－1，4－苯醌)．其在PSB中含量较高且相对稳定，可以用它的含量来定量表征PSB的菌体产量．目前CoQ10的检测方法包括紫外分光光度法、可见分光光度法、HPLC法等．同样由于废水中杂质的干扰，导致不能使用分光光度法分析CoQ10的质量．可选的检测方法只有HPLC法，目前测定废水中PSB内CoQ10质量的HPLC方法，国内外未见报道．因此本文研究采用HPLC法分析CoQ10的含量以表征废水中PSB的菌体含量，排除各种干扰因素，拟建立定量分析废水中PSB菌体产量的方法，以期为PSB在废水中的检验与定量分析提供科学依据．1试验1.1材料试验所采用的光合细菌为球形红假单胞菌(Rp．sphaeroids)，购于中科院微生物研究所．试验采用活性污泥模拟废水中各杂菌，污泥取至处理生活污水A/O工艺的二沉池．试验废水采用浊度较大，有机物质含量较多的人工配水来模拟大豆废水．试验仪器与药品:冰箱(BCD－216ST，Haier);超声波清洗器(HS3120，BENCHTOP-CLEANERS);高效液相色谱(Agilent1200，Agi-lentTechnologies，Inc．)．CoQ10标准品(Sigma公司生产);甲醇、无水乙醇、乙腈、丙酮均为色谱纯．1.2方法CoQ10标准样品的制备:取CoQ10标准样品30mg，加入无水乙醇40mL，在50℃水浴中震荡溶解．放冷后，转移至100mL容量瓶中，用无水乙醇稀释至刻度摇匀，作为标准品母液，将母液分别稀释为3.0、2.5、2.0、1.5、1.0mg/L．所有样品均经0.45μm膜过滤待用．纯培养基中CoQ10的提取方法:取2.5mL发酵液在11000r/min的条件下离心10min，分离上清和菌体．菌体用去离子水洗至中性，得到菌体细胞待用．CoQ10的提取采用冻融辅助超声法［8］，将菌体细胞放入冰箱冷冻区冷冻24h后提取溶剂．样品均经0.45μm膜过滤后取上清液进行HPLC分析．杂质中CoQ10的提取方法为:分别取7200mg/L的大豆废水、160mg/L的PSB、7200mg/L的大豆废水加160mg/L的PSB，CoQ10的提取方法同上．杂菌中CoQ10的提取方法:取2.5mL质量浓度为10000mg/L的活性污泥，在11000r/min的条件下离心10min，分离上清和菌体．菌体用去离子水洗至中性，得到菌体细胞，CoQ10的提取方法同上．不同培养条件CoQ10的提取方法:将PSB在纯培养基中纯培养7d，光照－溶解氧条件分别为光照－厌氧、黑暗－好氧、自然光－微好氧．分别取不同培养条件的发酵液2.5mL，CoQ10的提取方法同上．不同生长时期CoQ10的提取方法:将PSB在纯培养基中培养，光照－溶解氧条件为自然光－微好氧．分别在第24、48、72、96h取发酵液2.5mL，CoQ10的提取方法同上．安静等研究［9］表明PSB生长前36h为延滞期，36～72h为生长期，从72h开始进入稳定期，96h以后细胞进入衰亡期．加样回收率试验方法:采用外标加样回收法，取已知含量的CoQ10样品5份，精密称定，分别置具塞的锥形瓶中，加同量的废水(7200mg/L)、PSB(160mg/L)，CoQ10的提取方法同上．2结果与讨论2.1色谱条件流动相的选择:选用的色谱柱为SphherisorbC18(10cm×4.6mmID)柱，柱温35℃，紫外检测波长275nm，进样量15μL．流动相分别为甲醇和水、甲醇和乙腈、无水乙醇和水、甲醇和无水乙醇．当流动相为甲醇和水时，检测不到CoQ10标准品．当流动相为甲醇和乙腈时，两者任意比例关系下，色谱峰或者不出峰，或者峰型不对称．当流动相为无水乙醇和水时，由于无水乙醇粘度大，CoQ10标准品的保留时间长，柱压特别高．当流动相为甲醇和无水乙醇时，色谱峰峰型对称出峰较好，因此对甲醇与无水乙醇的比例进行深入研究．分别配制甲醇与无水乙醇的体积比为1∶1、3∶2、4∶1、9∶1进行实验，随着流动相甲醇比例的增加CoQ10标准品的保留时间缩短，当甲醇和无水乙醇·54·哈尔滨工业大学学报第43卷比例为3∶2时，在28.773min出峰，当两者比例为4∶1时，在23.257min处出峰，当两者比例为9∶1时，在21.183min处出峰．综合比较后发现，不同比例甲醇与无水乙醇为流动相时峰型都很好，出峰时间选择甲醇与无水乙醇的比例为9∶1．流速的选择:当流速为0.6mL/min时，CoQ10标准品的保留时间超过35min，保留时间过长．当流速为1.5mL/min时，柱压过高．当流速为1mL/min时，CoQ10标准品的保留时间21.183min，柱压16.4MPa．综合比较，选择流速为1mL/min．综合上述结果，本文提出的色谱条件:色谱柱为SphherisorbC18(10cm×4.6mmID)柱;甲醇与无水乙醇(体积比9∶1)为流动相;流速为1mL/min;柱温为35℃;紫外检测波长为275nm;进样量为15μL;柱压为16.4MPa．在此条件下，色谱出峰快、峰型良好．采用如上确立的HPLC检测方法，获得CoQ10标准品谱图与标准曲线分别见图1与图2，由图可见，CoQ10标准品的保留时间为21.183min，CoQ10标准品密度与峰面积具有良好的相关性．0.020.010-0.017.515.022.530.0t/minU/V图1CoQ10标准品HPLC色谱图2.2提取溶剂的选择由于CoQ10为细胞内物质，其提取效果的好y=623.32x-37.487R2=0.984820001500100050000.71.42.12.83.5籽(COQ10)/(10-3g·L-1)峰面积/(V·s)图2CoQ10标准曲线坏直接关系到产品的收率，许芳等研究表明采用乙醇与丙酮对PSB中CoQ10提取效果较好．本文对菌体细胞分别采用:1)无水乙醇提取5h;2)丙酮提取5h;3)丙酮提取5h后，挥发去除全部丙酮，用无水乙醇溶解．不同提取溶剂对CoQ10提取率的影响见图3，可见，先用丙酮提取5h后，挥发掉全部丙酮，再用无水乙醇溶解，这一提取方法相对提取率最高．1209060300乙醇丙酮先乙醇后丙酮相对提取率/%图3不同溶剂对CoQ10提取率的影响2.3外标加样回收率及检测限实验采用上述确立的检测方法及提取方法，并进行外标加样实验，加样回收率见表1．平均回收率为99.13%，相对标准偏差为0.81%(n=5)．实验表明，上述方法精密度高，重复性好，可用于CoQ10的提取与检测．表1加样回收率(n=5)样品中CoQ10质量/mg