TTC脱氢酶活性测定法的改进牛志卿

1994年21(l)微生与0.smol/LNaOH处理样品后,两种方法测定的结果都与样品中所含实际蛋白量接近,而用1·omol/LNaOH处理后测得的值则偏低。NaOH的浓度过高时测得的蛋白含量偏低,其原因需进一步探讨。物学通报品,以Lowry法测定细菌总蛋白含量,虽然比通常采用1.omol/LNaOH直接处理细菌细胞的方法麻烦些,但测定的值更接近于真实含量。参考文献表2不同浓度NaOH处理BSA后两种测定方法的结果〔l〕[2〕乃11刁」勺JJ峥厂L厂LNaOH(mol/L)LowryCBBG25o98.84士0.2198.80士0.1099.26士0.2199.03士0.1590.03士0.1592.67士0.61LowryOH,etal.JBiolChem.1951,193:265.〔日」微生物研究法讨论会编,程先胜等译.微生物学实验法,北京:科学出版社,1981·192·[日〕营原洁·副岛正美著,张旭译.蛋白质的定量法.第二版.北京:农业出版社,1981·108一115·周德庆.微生物实验手册.上海:上海科学技术出版社,1986,352.张龙翔等.生化实验方法和技术.北京:人民教育出版社,1981.165一167·BradfordMMAnalBioehem.1976,72:248一254.刁J工Jes二J幽乃厂IL广L综上所述可见,即先将细菌细胞破碎,然后再用低浓度(0.lmol/L)Na0H处理细菌样TTC一脱氢酶活性测定法的改进牛志卿刘建荣吴国庆(太原工业大学市政与环境工程系,太原。30024)摘要以紫色非硫光合细菌、枯草芽袍杆菌为材料,改进了TTC一脱氢酶活性的测定方法。在该法中样品不需处理,在常温下用三氯甲烷代替丙酮萃取,液一液分层效果好,显色稳定但不褪色。对测定中的诸多影响因素也作了研究,确定了改进后的脱氢酶活性测定的最佳条件。关镇词脱氢酶,脱氢酶活性,紫色非硫光合细菌,枯草芽抱杆菌废水生物处理及活性污泥消化的实质,是经微生物所产生的多种酶催化一系列的生物氧化还原反应。其中,脱氢酶能使被氧化有机物的氢原子活化并传递给特定的受氢体。因而,脱氢酶的活性可以反映处理体系内活性微生物量及其对有机物的降解活性,以评价降解性能。也可应用该酶活性做为检测金属对活性污泥的毒性指标。因此,脱氢酶活性的检测在废水生物处理中甚为重要。测定脱氢酶的方法很多卜3〕,目前应用较多的是氯化三苯基四氮哇(TTC)法[’j。该法主要选用无色的TTC做为人为受氢体,受氢后生成深浅不同的红色三苯基甲腊(TF)。原法用丙酮作为TF的萃取剂,溶液显色不稳定,易褪色。采用三氯甲烷代替丙酮在常温下进行萃取,操作条件简单,易掌握,经济实用。1材料与方法1.1材料1.1.1菌种:紫色非硫光合细菌(Purplenonsulfurphotosyntheti。Baeteria简称PSB)由本组分离筛选。枯草芽袍杆菌(Baclllassu占tizi:简称B.s)由山西医学院提供。1.1.2培养基:YP培养剂川或修改后的van1993一04一15收稿DOI:10.13344/j.microbiol.china.1994.01.017·60·徽生物学Niel液体培养基[`〕。1.1.3菌液:取培养好的新鲜菌液,50o0r/min离心40分钟。弃去上清液,称菌体湿重,用蒸馏水配成浓度为309/L的待用菌液。1.2主要试剂氯化三苯基四氮哇(TTC)一葡萄糖标准溶液:TTCo.19与葡萄糖19共溶于looml蒸馏水中,棕色试剂瓶保存,一周更换一次。三轻甲基氨基甲烷(Tris)一HCI缓冲溶液。PHS.4。三氯甲烷(分析纯)。1.3方法1.3.1标准曲线的绘制:在分液漏斗中,分别加入不同量的TTC一葡萄糖标准溶液,Tirs-HCI缓冲溶液Zml及足量的连二亚硫酸钠,摇匀;待溶液充分显色后,准确加入三抓甲烷溶液sml进行萃取,放置片刻;待溶液分层后,移至cIm比色皿中。以试剂空白作对照,用721分光光度计在波长485nm处测对应的吸光度(A)值,对脱氢酶活性作图,绘制标准曲线。1.3.2脱氢酶活性的测定:分别准确取定量的实验待用菌液,各加入Tirs一HCI缓冲溶液Zml和TTC一葡萄糖标准溶液Zml,置于37士1℃恒温培养箱中,反应2小时显色后,准确加入三氯甲烷溶液sml,在常温下进行萃取。其余步骤同标准曲线绘制。在上述条件下,将1小时产生1拜gTF的量定义为一个酶活力单位。通报1994年21(1)脱氢酶与TTC反应生成TF。TF颜色越深说明脱氢酶的活性越高。因而TF的萃取是关键所在。首先对文献中已报道的丙酮、乙醇、正丁醉三种萃取剂及本实验新选用的三氯甲烷萃取剂进行了筛选。按照标准实验方法,反应完毕后,在常温下进行萃取。实验结果表明(表l)。衰1不同草取荆的吸光度(A)值溶液混浊在同等条件下,丙酮作萃取剂溶液发生混浊,显色不稳定。三氯甲烷作萃取剂,液一液分层好,显色稳定,吸光度(A)值最大;萃取完毕,只须在分液漏斗下口放少许脱脂棉,萃取液直接放入比色皿中即可测定。所以三氯甲烷是一种较理想的萃取剂。萃取时间的比较结果表明,当萃取l、2、3、4、5分钟时以3分钟最适宜。操作时要连续不断振摇,注意放气,否则会影响(A)值。.22缓冲液的选择将不同种类的缓冲液都调至pHS.4,分别加入反应液中。实验结果表明(表2),从反应液的(A)值及溶液反应后的pH值变化情况来看,选用iTsr一HCI缓冲液较好,因为该缓冲溶液有较大的缓冲能量。2.1结果与讨论萃取剂的选择衰2不同级冲溶液的吸光度(A)位Tris一HCIA反应后pH}A巴比妥钠反应后pH磷酸盐A反应后pH甲酸盐A反应后pH0.0580.0440.0540。0550.1750.1670.1400.1001994年21(l)徽生物2.3pH值对酶活性的影响在不同pH值条件下进行反应,测其相对应的酶活力。结果表明,两种菌体脱氢酶反应的pH值适应范围为7一9,最适pH值为8一8.4。2.4温度对酶活性的影响分别于不同温度条件下进行反应,测不同温度时相对应的酶活力。结果表明,枯草芽抱杆菌耐热性强,脱氢酶的活性在35一45℃最高;而光合细菌酶活性的适应范围较广,为25一40℃,最适反应温度在30一40℃。2.5显色时间对酶活性的影响学通报在标准实验条件下进行反应,每隔1小时取样测其酶活性。结果表明(图1,图2),B.S在一定时间内,反应时间越长,反应液的TF颜色越深,吸光度(A)值越大;但随着时间的延长,反应速率(A/h)趋于平缓,反应到2小时最佳。此时显色达到高峰,反应速率最大。PSB在4小时后脱氢酶的活性逐渐降低,TF色度变浅。这可能是由于PSB在氧化还原作用下破坏了TF的共扼体系,有待进一步研究检验。对不同菌龄的PSB及枯草芽抱杆菌作了显色时间的比较。结果表明,幼龄菌体反应较快,老龄菌体反能较慢。因此,显色时间与菌龄有关。…夕丫ù廿4:00`u吹OO呼ǎq、哎à赞溯创喊64n`000.0ù.0.0.03.02.01--e导咬024时间(h)02时间(h)图1B.S脱氢醉反应时间与反应速率图2PsB脱氢酶反应时间与反应速率x反应时间△反应速率x反应时间△反应速率LenhardGetal.WaterPollutionRes.1965,2:105一109.Hirayama.WaterRes.1986,20(4):491一492.KlapwijkAetal.WaterRes.1974,8(2):121.俞毓璐等.环境工程徽生物检验手册.北京:中国环境科学出版社,1990,163一165·吴永强等.徽生物学通报.1984,n(1):17·郑士民等.自养微生物.北京:科学出版社,1983,192一193.勺J门lJJes门」llC`口伪左二一ILFLL.L工weL.2`终止剂的选择文献报道的终止剂有多种,如硫酸、乙醇等。本实验采用反应完毕后立即萃取测定,并与从培养箱中取出在室温下放置10分钟后萃取相比较。二者酶活性误差0.5%,因此,可不使用终止剂。参考文献