氨氮降解菌的筛选鉴定与复合菌水质调控效果研究

doi:10.7541/2019.104氨氮降解菌的筛选、鉴定与复合菌水质调控效果研究陈红菊1*王慧1*孔维祎2许高朋1王晓云1赵燕1季相山1(1.山东农业大学山东省动物生物工程与疾病防治重点实验室,泰安271018;2.中国农业大学(烟台)海洋学院,烟台264000)摘要:为寻找高效降解水体中氨氮的菌株并对其进行应用评价,研究从多种水产养殖池塘水体和底泥的混合物中筛选出2株氨氮降解菌,降解率分别达97.8%和98.5%,经鉴定均为凝结芽孢杆菌(Bacilluscoagulans)。对筛选出的2菌株培养条件进行优化,2菌株pH、C/N适应范围广,并且耐高温、高盐。通过灌服试验表明所筛选菌株对养殖动物是安全的。在此基础上,将筛选菌株与本实验室前期诱变菌株B38复配后制成复合菌,通过养殖试验评价了复合菌对氨氮、亚硝酸盐及藻类数量的调控效果。与4种商品微生态制剂(光合细菌、酵母菌、强效EM和芽孢杆菌)相比,泼洒复合菌的池塘氨氮含量逐渐降低。在氨氮含量下降的同时,亚硝酸盐含量有上升的趋势,但在试验的第18天,复合菌组与酵母菌组亚硝酸盐含量有所降低。对藻类数量的影响结果显示,从第9天开始添加复合菌与芽孢杆菌组藻类数量高于其他各组,在第14天,这2组藻类数量大约为其他组的2倍。由此可见,复合菌具有明显的降氨氮特性,并能有效增加藻类数量,但对亚硝酸盐降解效果不显著。研究为复合型微生态制剂的开发提供了技术支撑。关键词:氨氮降解菌;复合菌;氨氮;亚硝酸盐;藻类中图分类号:Q938.3文献标识码:A文章编号:1000-3207(2019)04-0875-09在水产养殖中,投入水体中的饲料只有约25%的蛋白被水产动物吸收利用,多数饲料蛋白通过粪便、残饵、分泌物等形式重新流失到水体中[1,2],造成含氮有机物在水体中累积,当这些有机物过多,难以被天然的微生物完全分解时,便造成了水质恶化,从而引发水体缺氧、水生动物发病甚至死亡等一系列后果。因此,人为地施加能高效分解残饵、粪便等有机物的微生物菌种是非常有必要的[3]。为了将大的有机物分解掉,施加的菌株最好是复合菌,从功能上分主要包含2大类,第一类是能将大的有机物分解为氨氮等小分子有机物的菌株;第二类是将氨氮等进一步转化为氮气等气体的菌株。枯草芽孢杆菌(Bacillussubtilis)具有强大的产酶系统,在其生长繁殖期间,特别是在稳定期能够分泌大量的中性蛋白酶、碱性蛋白酶、淀粉酶、纤维素酶、植酸酶等数十种酶[4],可将残饵、粪便等有机物分解为氨氮等小分子物质,主要行使第一类菌的功能。为了提高枯草芽孢杆菌等分解大分子有机物的能力,人们多从提高其酶活性方面开展相关研究,如通过紫外诱变等手段筛选和培育高产酶活性的枯草芽孢杆菌等[5,6]。蔡婉玲等[7]利用紫外诱变使菌株产蛋白酶活性提高了15.6%。本实验室前期通过紫外诱变的方法获得了能稳定遗传的高产蛋白酶活性的突变菌株B38,其降解饲料中可溶性蛋白的能力提高了2.57倍[8]。氨氮等进一步转化为氮气等气体的过程较为复杂,需要经过氨氧化、硝化、反硝化等众多途径,中间会形成硝酸盐、亚硝酸盐、一氧化二氮等中间产物[9],一般需要一个或多个菌株的共同参与才能完成。前期人们已筛选了大量的降解氨氮的菌株[9—12],但从养殖水体和底泥中直接筛选降解氨氮菌株的报道并不多。第43卷第4期水生生物学报Vol.43,No.42019年7月ACTAHYDROBIOLOGICASINICAJul.,2019收稿日期:2018-08-28;修订日期:2019-03-11基金项目:山东省现代农业产业技术体系虾蟹类创新团队环境调控岗位(SDAIT-13);山东省“双一流”奖补资金资助[SupportedbytheEarmarkedFundforModernAgro-industryTechnologyResearchSysteminShandongProvince(SDAIT-13);FundsofShandong“DoubleTops”Program]作者简介:陈红菊(1972—),女,河北任丘人;博士;主要研究方向为水环境调控与水产动物遗传育种。E-mail:[e-mail];王慧(1990—),女,山东泰安人;硕士;主要研究方向为水环境调控。E-mail:[e-mail]*共同第一作者通信作者:季相山(1977—),男,山东临沂人;博士;主要研究方向为水环境调控与水产动物遗传育种。E-mail:[e-mail]本研究在前期试验的基础上,为了进一步提高水体中含氮有机物分解效果,拟从多种水产动物的养殖池塘中筛选出高效的氨氮降解菌,优化其培养条件,并通过灌服试验检测其对养殖生物的安全性。再将筛选菌株与B38[8](能分解饲料蛋白的枯草芽孢杆菌)复配后制成复合菌,通过养殖试验与4种商品微生态制剂(光合细菌、酵母菌、强效EM和芽孢杆菌)进行比较,评价复合菌液在水质调控方面的效果,为复合型微生态制剂的开发提供技术支撑。1材料与方法1.1试验材料菌株:用于筛选菌株的样品取自泰安、济宁和南宁的多处养殖池塘或自然水体(表1),共计82份。试验用鱼:黄河鲤(10—12cm)、鲢、鳙(8—10cm)取自泰安市水产研究所。光合细菌、酵母菌和强效EM由山东宝来利来生物工程股份有限公司惠赠;芽孢杆菌购自广州利洋水产科技股份有限公司。1.2菌株的分离鉴定菌株的筛选与评价　　采集的水样不做处理,可直接作为样品液使用。对采集的泥样做以下处理:分别称取1g泥样加入到装有9mL无菌生理盐水的离心管中,30℃振荡活化30min,静置15min后取上清液,由此制得泥样悬浮液。采用定向富集分离法对采集的样品进行菌株富集分离[13]。将样品以1%的接种量接种到初始氨氮浓度为50mg/L的高浓度氨氮培养基中,进行连续6次的富集驯化培养,每次的驯化周期为3天。在驯化结束后采用平板划线法分离筛选菌株,共筛选出9株,划线纯化3代后置于−80℃冰箱保存备用。将分离得到的9株耐受基础菌株摇菌后制成A600为1的菌液,分别接种到装有20L水的容器中,接种量终浓度为107个/mL,氨氮初始浓度为50mg/L。试验用水进行曝气、充氧,每隔24h测定水体的氨氮浓度,测定3次。菌株的鉴定　　形态学观察:将xh1和xh7用革兰氏染色法染色后,依照《常见细菌系统鉴定手册》[14]对细菌种类进行初步鉴定。生理生化鉴定:API50CHE试验条和apiweb-API50CHBV3.0分析鉴定数据库(BioMérieux公司)、BioNumerics生物分析软件(AppliedMaths公司)对xh1和xh7进行生理生化鉴定[15]。以菌液为模板进行16SrDNA部分序列的PCR扩增,引物为:5′-AGAGTTTGATCMTGGCTGAG-3′,5′-TACGGYTACCTTGTTACGAGTT-3′。PCR扩增程序:94℃预变性4min,94℃变性30s,56℃复性45s,72℃延伸90s,35个循环后72℃延伸7min,4℃保存。选取阳性克隆测序,所得序列进行Blast比对,利用MEGA5.05软件构建进化树,对菌株进行分子鉴定。1.3菌株培养条件的优化筛选得到的xh1和xh7菌株菌悬液分别接种于优化培养基,进行单因素的条件优化,即在优化一个条件时,其他条件保持不变(温度30℃,C/N15,pH7.0,盐度0)。200r/min振荡培养,24h后测定菌液A600值。温度梯度设置:20℃、25℃、30℃、35℃、40℃。pH设置:6.0、6.5、7.0、7.5、8.0、8.5。盐度梯度设置:0、3‰、5‰、10‰、20‰、30‰。C/N梯度设置:2、5、10、15、20[16]。1.4菌株的安全性检测选取相同养殖环境、相同日龄、体重(50±2.48)g的黄河鲤660尾,平均分为11组,每组3个重复。暂养一周后进行试验。第1组灌服无菌生理盐水作为对照组。第2至第6组灌服不同浓度的xh1菌液,第7至第11组灌服不同浓度的xh7菌液,菌液浓度分别为105、106、107、108和109cfu/mL。每尾试验鱼灌服剂量为0.5mL,连续灌服3d,观察时间为14d,相同条件饲养,观察摄食能力及行动状态,统计14d内的累计死亡率。表1采集样品相关信息Tab.1Sampleinformation采样日期Samplingdate采样地点Samplinglocation水样份数Watersamplenumber泥样份数Mudsamplenumber2015.06.29　济宁乌鳢养殖池塘622015.07.20　南宁尼罗罗非鱼养殖　池塘112015.07.20　南宁罗氏沼虾养殖　　池塘112016.05.25　泰安周边多处自然　　水域20142016.05.28　泰安市水产研究所鲤　鱼养殖池塘222016.05.28　济宁微山湖湿地232016.05.28　济宁天源养殖场鲤鱼　养殖池塘542016.05.29　济宁微山湖水体(二级　坝附近)112016.06.01　泰安温泉水产养殖试　验场尼罗罗非鱼养殖　池塘106876水生生物学报43卷1.5复合菌与四种商品微生态制剂对水质调控效果的评价复合菌的配制:xh1、xh7是本研究筛选出的2个高效氨氮降解菌,B38是本实验室通过诱变筛选得到的高产蛋白酶的菌株[8]。将xh1、xh7和B38培养至109个/mL时,离心浓缩后以1鲶1鲶1的比例复配成复合菌。试验设计:共设置5个试验组(分别泼洒复合菌、光合细菌、酵母菌、强效EM菌、芽孢杆菌)和2个对照组(不泼洒益生菌),其中1个对照组正常投喂饲料,另1个不投喂饲料,所有试验组都投喂饲料。试验用益生菌在泼洒前均用梯度稀释法进行菌种计数,菌液泼洒终浓度为107个/L。每组3个池塘重复。各组池塘中饲养鲤、鲢和鳙,鲤放养密度为(207±7.58)g/m3,鲢和鳙放养比例为3鲶1,放养密度为(57±3.24)g/m3,日投饵量为鱼体重的4%—5%,试验期间每个池塘投饵量都一致,日投饵量120g。试验所用池塘初始水体积为8m3,调节各池塘的水体初始pH为7.5,试验水温控制在25—30℃。向各水体内添加NH4Cl溶液,调节水中初始总氨氮(TAN)浓度至6mg/L。在试验过程中,选取不同时间点取样,测定各项水质指标。氨氮、亚硝态氮测定的取样时间为:0(加入微生态制剂后的6h)、1d、5d、9d、11d和18d,藻类测定的取样时间为:0(加入微生态制剂后的6h)、5d、9d和14d。总氨氮的测定:采用纳氏试剂法[17]测定。计算公式:ρ=A水样/b×25.0/V水样亚硝态氮的测定:采用重氮偶合分光光度法测定。藻类数量的测定:采用浓缩沉淀法[18]测定。1.6数据分析数据均用平均值±标准差的形式表示,用软件Excel2016和SPSS21.0对数据进行统计分析和显著性检验(P0.05)。2结果2.1氨氮降解菌的筛选、培养条件优化与安全性检测氨氮降解菌的筛选　　本试验共采集82份样品(表1),采用定向富集分离法筛选高效降解氨氮的菌株,共筛选出9株菌株,命名为xh1-xh9。这9株菌降氨氮效果评价试验显示,24h时xh1和xh7两株菌对氨氮的降解率均达到90%以上。72h时xh1与xh7菌株的降解率分别达97.8%和98.5%。二者在各个时间点对氨氮的降解率均显著高于其他菌株(表2)。菌株的鉴定结果　　显微镜观察发现,2个菌株胞体均呈杆状,能形成芽孢,无鞭毛,两端钝圆,单个或少数呈短链状。经革兰氏染色均呈阳性。依据《伯杰细菌鉴定手册》和《常见细菌系统鉴定手册》将其初步鉴定为芽胞杆菌属。将培养好的菌液接种于API50CH芽孢杆菌鉴定试剂条,得出该菌株的生理生化反应谱。经计算机软件鉴定,xh1、xh7与凝结芽孢杆菌(Bacilluscoa-gulans)的相似度分别为99.6%与96.9%。从筛选菌株基因组扩增到长度约1500bp的16SrDNA序列,在NCBI中BLAST比对结果显示,xh1与xh7序列与凝结芽孢杆菌的相似性在99%以上