包埋厌氧氨氧化的脱氮特性及其微生物群落结构王维奇

中国环境科学2018,38(9)：3343~3350ChinaEnvironmentalScience包埋厌氧氨氧化的脱氮特性及其微生物群落结构王维奇,王秀杰,李军*,王思宇(北京工业大学建筑工程学院,北京100124)摘要：采用聚乙二醇二丙烯酸酯作为载体,分别以N,N,N,′N′-四甲基乙二胺(TEMED),过硫酸钾(KPS)作为促进剂和引发剂,对厌氧氨氧化菌进行包埋固定化.采用正交试验优化包埋条件,得到的最佳条件为:10%PEGDA单体,0.25%KPS,0.5%TEMED,最佳的操作条件为:聚合温度20,℃聚合时间控制在5min左右,菌胶比选取1:1.包埋颗粒的连续流实验表明,颗粒经过短暂的活性恢复后,脱氮效果不断提升,并且对水力负荷的提高有一定的抗冲击能力.扫描电镜(SEM)表明本实验包埋材料具有很好的生物相容性,且具有良好的传质性能.高通量测序显示,稳定运行一段时间后,颗粒内微生物多样性略有减小,厌氧氨氧化功能菌CandidatusKuenenia占整个微生物体系比例由6.58%上升至9.8%,微生物种群的变化说明了包埋后厌氧氨氧化性能能够得到更大的提升.关键词：厌氧氨氧化菌；聚乙二醇二丙烯酸酯；包埋；脱氮；微生物群落结构中图分类号：X703.5文献标识码：A文章编号：1000-6923(2018)09-3343-08Nitrogenremovalcharacteristicsandmicrobialcommunitystructureanalysisofentrappedanaerobicammoniumoxidizingbacteria.WANGWei-qi,WANGXiu-jie,LIJun*,WANGSi-yu(TheCollegeofArchitectureandCivilEngineering,BejingUniversityofTechnology,Beijing100124,China).ChinaEnvironmentalScience,2018,38(9)：3343~3350Abstract：Usingpolyethyleneglycoldiacrylateascarriermaterials,respectivelywithN,N,N,′N′-tetramethylethylenediamine(TEMED)aspromoterandpotassiumpersulfate(KPS)asinitiatortoimmobilizeanaerobicammoniumoxidizingbacteria.Orthogonalexperimentswereusedtooptimizeimmobilizationconditionsofanaerobicammoniumoxidationbacteria:10%PEGDAmonomer,0.25%KPS,0.5%TEMED,theoptimumoperationconditionwastocontrolthepolymerizationtemperatureat20,℃polymerizationtimewasabout5min,Theratioofbacteriatogumwas1:1.Thecontinuousflowexperimentofimmobilizedpelletsshowedthatafterashortperiodofactivityrecovery,thenitrogenremovaleffectwascontinuouslyimproved,andithadacertainimpactresistancetotheincreaseofhydraulicload.Thescanningelectronmicroscopy(SEM)showedthattheimmobilizationmaterialshavegoodbiocompatibilityandgoodmasstransferperformance.High-throughputsequencingshowedthatafteraperiodoftimeofstableoperation,themicrobialdiversityinthepelletsdecreasedslightly.AndtheCandidatusKueneniathatbelongstoanaerobicammoniumoxidizingbacteriawhichaccountedfor6.58%ofthetotalmicrobialsystemwasupto9.8%,thechangesinmicrobialpopulationshowedthattheperformanceofanaerobicammoniumoxidationcouldbeimprovedgreatlyafterimmobilization.Keywords：anaerobicammoniumoxidizingbacteria；polyethyleneglycoldiacrylate；immobilization；nitrogenremoval；microbialcommunitystructure厌氧氨氧化(ANAMMOX)是指在厌氧或缺氧条件下,一类浮霉菌门细菌以亚硝酸盐为电子受体,将铵盐氧化产生氮气并产生少量硝酸盐的过程[1-3].与传统生物脱氮工艺相比,厌氧氨氧化工艺具有能耗低,占地面积小,产生的剩余污泥量少,不需要外加有机碳源等优点[4].但无论是絮状还是颗粒厌氧氨氧化污泥,都存在菌体流失,颗粒形成过程缓慢的问题[5-6];因此减少或者防止厌氧氨氧化菌体流失,保持生物量成为研究厌氧氨氧化工艺的主要方向之一[7-8].20世纪70年代中期,水处理领域引入了微生物固定化技术,目前该技术已进入实用开发阶段.微生物固定化技术是经过特定的技术方法将细菌细胞固定在一定的载体上,能够减少甚至防止发生菌体流失现象,并提高细菌的可利用率,从而达到简化处理工艺,提高应用效率的目的[9].包埋法固定微生物是目前普遍应用的一种固定化方法[10-11],其采用特定的材料将微生物菌株包埋在半透性的聚合物凝胶或膜内,以达到提高生物量的目的.然而现有包埋材料制备的厌氧氨氧化包埋颗粒普遍存在生物活性低,机械强度不足,长期运收稿日期：2018-03-05基金项目：水体污染控制与治理科技重大专项(2015ZX07202-013);北京市基金面上项目(8172012)*责任作者,教授,[e-mail]:10.19674/j.cnki.issn1000-6923.2018.03603344中国环境科学38卷行稳定性不够等一系列问题,即使通过各种方式对包埋颗粒进行强化,效果也并不明显[12-13].另外,由于厌氧氨氧化菌的世代周期长,细胞产率低,且易受环境条件影响等特点[14],使得厌氧氨氧化菌的包埋成为难点.聚乙二醇二丙烯酸酯作为一种新型包埋材料,多用于硝化菌以及反硝化菌的固定化研究,例如将其用于包埋硝化细菌,并与弹性塑料填料硝化生物膜反应器作对比,启动30d后,包埋反应器硝化速率达到39mgN/(L·h),优于生物膜25mgN/(L·h)[15];此外,将其作为反硝化菌的载体,用于处理硝酸盐合成废水,16d后,发现反硝化速率高达4.4kgN/(m3·d)[16].然而其用于包埋厌氧氨氧化菌的研究却鲜有报道.因此本实验采用其作为固定化介质[17],对厌氧氨氧化菌进行固定化试验.为制备具有良好机械性能和脱氮效果的包埋颗粒,本实验设计了正交试验对包埋条件进行了优化.并观察了包埋颗粒长期运行的稳定性,分析了运行前后微生物群落的变化,以探索本包埋材料的特点以及应用的优势.1材料与方法1.1实验材料和仪器厌氧氨氧化污泥取自实验室稳定运行4a的UASB反应器[18];实验所用药剂及仪器:聚乙二醇二丙烯酸酯(PEGDA),生化试剂;四甲基乙二胺(TEMED),生化试剂;过硫酸钾(KPS),分析纯;磷酸二氢钠(NaH2PO4·2H2O),分析纯;磷酸氢二纳(Na2HPO4.12H2O),分析纯;氯化钠(NaCl),分析纯;氯化钾(KCl),分析纯.实验用水采用人工配水,主要成分见表1,微量元素Ⅰ和Ⅱ参照文献[19],pH值为7.5~8.0.表1人工模拟废水成分组成Table1Compositionsofartificialwastewater主要成分质量浓度KH2PO425mg/LCaCl2120mg/LMgSO4·7H2O260mg/LKHCO3753mg/L微量元素Ⅰ1ml/L微量元素Ⅱ1ml/L微量元素Ⅰ组成:FeSO4,5g/L;EDTA,5g/L;微量元素Ⅱ组成:EDTA,15g/L;CuSO4·5H2O,0.2g/L;ZnSO4·7H2O,0.43g/L;CoCl2·6H2O,0.24g/L;MnCl2·4H2O,0.99g/L;NaMoO4·2H2O,0.22g/L;NiCl2·6H2O,0.19g/L;NaSeO4,0.11g/L;H3BO3,0.014g/L;NH4+-N,NO2－-N分别用NH4Cl和NaNO2按需配制.1.2固定化颗粒的制备1.2.1污泥浓缩液的制备由UASB反应器取得的厌氧氨氧化颗粒污泥,将其打碎,经PBS(0.1mol/L,pH7.4)冲洗2~3次,除去污泥表面的残留基质,4000r/min离心10min,制得污泥浓缩液.1.2.2包埋颗粒制作过程取一定量PEGDA溶解于磷酸缓冲溶液中,加入一定量的TEMED并将pH调至7.0,将制得的溶液与污泥浓缩液按一定比例混合,搅拌均匀.加入一定量KPS,迅速搅拌,一定温度下(20~30℃)聚合一定时间后混合液成固态,将形成的凝胶切成3mm×3mm×3mm的立方体,即得PEGDA包埋颗粒.将制得的包埋颗粒用去离子水冲洗彻底,将未交联的PEGDA单体和未固定的厌氧氨氧化菌洗出.而后浸泡于去离子水中,低温避光贮存.1.3分析方法1.3.1水质分析方法NH4+-N:纳氏试剂光度法;NO2－-N:N-(1-萘基)-乙二胺分光光度法;NO3－-N:麝香草酚分光光度法;pH/温度:WTW/Multi3420测定仪.1.3.2包埋颗粒机械稳定性测定方法取大小相似的包埋颗粒各30粒加入血清瓶反应器(图1)中,加入400mL去离子水,600r/min磁力搅拌48h后观察完好包埋颗粒占原颗粒数的比例[20].1.3.3厌氧氨氧化性能的测定方法包埋颗粒厌氧氨氧化性能测定装置如图1所示.取活化后的包埋颗粒40mL,转入500mL的带塞血清瓶中,血清瓶用黑色反光纸包裹,加入400mL人工废水,放在恒温磁力搅拌器上.进气口通过通高纯氮气30min左右以吹脱水中的溶解氧进而保证厌氧环境.磁力搅拌器转速150r/min,温度保持30.℃隔一定时间用注射器通过进气口取样.每个实验设置3组平行取平均值.1.3.4扫描电镜分析包埋颗粒扫描电镜(SEM)分析:取出包埋颗粒,清洗后经2.5%戊二醇固定1.5h,PBS清洗3遍,随后经体积分数为50%,70%,80%,90%,100%乙醇梯度脱水,每次10~15min,最后用乙酸异戊酯置换,冷冻干燥24h后在样品表面镀9期王维奇等：包埋厌氧氨氧化的脱氮特性及其微生物群落结构3345上一层1500nm厚的金属膜,采用HitachiS-4300型扫描电镜进行观察.r/min℃r/minoffon恒温磁力搅拌器温度探头带塞血清瓶进气口出气口图1厌氧氨氧化性能测定装置Fig.1Anammoxactivitymeasuringdevice1.3.5连续流稳定运行及微生物群落结构分析(1)连续流运行:为了进一步研究包埋颗粒脱氮效果,采用连续流运行的方法,运行装置为有效容积约6L的UASB反应器,外部覆盖一层遮光保温层.水浴控制运行温度稳定在32℃左右.包埋颗粒通过琉璃球与鞭式填料按照体积填充率10%投加均匀分布于反应器中.实验采用人工配水,其中NH4+-N质量