PGD-PGS

着床前胚胎遗传学诊断和筛查PGS/PGD的应用进展北京大学第三医院生殖医学中心刘平010203PGS/PGD技术简介PGD案例分享PGD应用展望目录CONTENTSPGS/PGD临床意义染色体异常单基因遗传病Over7000kindsIncidencerateisabout1%Neonatalincidencerateis0.5-1%PGS:preimplantationgeneticscreening,对CNV变异的筛查PGD：preimplantationgeneticdiagnosis，诊断-综合临床问题PGT：preimplantationgenetictesting，检测-为诊断提供依据检测活检出的胚胎细胞是否含有亲代所携带的遗传异常,PGT更侧重于检测技术Evaluateswhetheracellbiopsiedfromadevelopingembryocontainsageneticabnormalityassociatedwithaspecificmedicaldisorderknowntoaffectoneorbothparents.PGT-APGT-SPGD临床适应证中华医学遗传学杂志,2018,35(2):151-155PGS临床适应证复发性流产，高龄女性，争议较大北医三院辅助生殖技术治疗量逐年快速增长YearFreshThaw198732——198845——1989116——199076——1991109——1992118——1993148——199415711995266111996229919972304199822315199928728200039774200162414020029603842003868459200417691155200523521510200630001881200734962275200845662578200955652859201081693314201110512412420121115245902013129405728201413887644220151506971762011-2015FreshCyclesAbove10,000,morethan140,000intotal5PGD/PGS实施数量增长2001~Sep2012:blastomerebiopsy,1or2blastocyststransferinthefreshcycle,FISHOct2012~:blastocystbiopsy,only1blastocysttransferinthethawedcycle,aCGH、SNParray、MALBACsequencing6PGD／PGS指征和应用现状JoannaLiss，2016，CurrentmethodsforpreimplantationgeneticdiagnosisPGS（110）reciprocaltranslocation（324）Robertsoniantranslocation（126）inversion（19）sexchromosomedisorder（38）sinlegenediease（48）otherchromosomaldisease（1）北医三院2016年:PGD/PGS共666周期PGS61%PGS16.7%北医三院生殖中心PGS病因（2017年）高龄2%复发流产[百分比]不良孕产史32%性染色体数目异常／Y微缺失6%RIF3%其它1%高龄胎停不良孕产史性染色体数目异常／Y微缺失RIF其它我中心PGS统计（2017年）(D0)获卵总数卵裂数活检胚胎数balance胚胎数移植囊胚数总数3039.001846.00691.00428.00174.00均值14.689.182.981.841.0245.0342.118.194.680.0010.0020.0030.0040.0050.00宫内妊娠未着床生化胚胎停育妊娠结局染色体结构异常携带者PGD进展方法进展：FISH，CGH，a-CGH，a-SNP，NGS诊断目标：目标染色体+全染色体平衡状态目标染色体核型正常+全染色体平衡“脱染”，区分携带者单基因病PGD难点•可供检测的遗传物质极少，需要借助全基因组扩增•全基因组扩增等位基因脱扣、覆盖度等影响检测结果•家系样本不全或新发突变的患者，不易进行PGD•检测胚胎遗传病的同时，需要保证胚胎染色体正常单基因病PGD难点-对策•选择合适的全基因组扩增方法•结合SNP连锁分析，排除ADO的影响•精子、极体、胚胎互推•PGD同时进行PGS，选择染色体正常的胚胎多重退火环状循环扩增（MALBAC）MALBAC三步扩增：1.第1轮扩增:添加特定的的扩增引物2.第2轮线性扩增:以第一轮产物为模板，形成完整扩增产物。3.指数扩增94℃使完整扩增产物的环状解链为线性，进行普通PCR指数扩增。ZongC,XieXS.Genome-widedetectionofsingle-nucleotideandcopy-numbervariationsofasinglehumancell.Science.2012.338(6114),1622-1626线性扩增，降低ADO，提高覆盖度，降低偏倚性ZongC,etal.Science,2012,338(6114):1622-1626.全基因组扩增技术比较关键指标比较中MALBAC技术优势明显：CV值最低（适用于PGS检测）；ADO最低（适用于PGD检测）；Annu.Rev.GenomicsHum.Genet.2015;16:79–102基于MALBAC-NGS的PGD检测流程囊胚活检MALBAC扩增染色体筛查SNP连锁分析致病位点检测综合考虑选择正常胚胎确定遗传模式构建SNP单体型进入PGD流程预实验010203PGD技术简介PGD案例分享PGD应用展望目录CONTENTS单基因突变、染色体异常、连锁分析的同时检测ProceedingsoftheNationalAcademyofSciences,2015,112(52):15964.单基因病PGD-MARSALAMALBAC单基因病PGD-MARSALACase1遗传性多发性骨软骨瘤显性遗传单基因遗传病ProceedingsoftheNationalAcademyofSciences,2015,112(52):15964.致病突变：EXT2，c.233delC单基因病PGD-MARSALA羊水、脐血结果证实不携带致病位点2014.9.19出生ProceedingsoftheNationalAcademyofSciences,2015,112(52):15964.Case2少汗型外胚层发育不良X连锁隐性单基因遗传病单基因病PGD-MARSALA女方携带X-连锁外胚层发育不良已有患儿8岁,无汗腺、毛发,不能坐立,智力不到1岁致病基因：EDA1，c.T1085GProceedingsoftheNationalAcademyofSciences,2015,112(52):15964.单基因病PGD-MARSALA极体、胚胎细胞联合检测，挑选正常胚胎移植，羊水、脐血验证正常2014.11.30出生ProceedingsoftheNationalAcademyofSciences,2015,112(52):15964.常染色体显性多囊肾病(ADPKD)是一种常见的遗传性疾病，其特点是肾脏、肝脏和其他器官有多发囊肿形成，囊肿进行性增大，约在50岁前出现肾衰。单基因遗传病PGD--降低PGT测序成本超声检查常染色体显性多囊肾做法：将MALBAC扩增产物分为3个部分，分别进行CNV检测、致病位点检测以及SNP分析。此方法测序测序数据量较少（1Mreads），成本较低，所以临床应用多，目前主要是这种做法结果解读1.女方：患者，PKD2，c.1034AG(p.Tyr345Cys)突变胎儿患者引产2.男方：不携带PKD2基因的位点突变；家系图谱EmbryosforPGD单基因遗传病PGD案例1预实验结果样本名称突变位点检测结果男方无突变女方PKD2,c.1034AG杂合突变引产患儿PKD2,c.1034AG杂合突变预实验结果SNP编号男方女方患儿正常单体型1正常单体型2正常单体型携带单体型SNP1GGGAA/GSNP2GGGAG/ASNP3AAGAA/ASNP4AATAA/ASNP5GGAGG/GSNP6AAGAA/ASNP7GGAGG/GSNP8AAGAA/ASNP9GGGAA/GSNP10GGGAA/GSNP11AAGAA/ASNP12CCTCC/CSNP单体型结果绿色字体，携带者单体型胚胎检测结果样本名称非整倍体检测结果致病位点及SNP检测结果WQJDE1_246,XN不携带母源突变WQJDE2_246,XN携带母源突变WQJDE3_246,XN不携带母源突变WQJDE4_246,XN,+17p(pter→p12,~13M,×3)携带母源突变WQJDE5_2多条染色体异常不携带母源突变WQJDE6_246,XN携带母源突变WQJDE7_247,XN,+1(×3)携带母源突变绿色底纹，正常胚胎胚胎检测结果案例2男方杂合突变:PKD1,c.9801GA女方正常男方父母正常家系图谱常染色体显性多囊肾-新发突变EmbryosforPGD利用男方单精子构建单体型预实验结果SNP编号女方男方单精子32单精子37正常单体型携带者单体型SNP1G/GAGG—SNP2A/AAC—CSNP3C/CTCCCSNP4G/GCG—GSNP5T/TTGGGSNP6T/TTC—CSNP7T/TGTTTSNP8A/AGA—ASNP9A/AGAAASNP10A/AGAA—SNP11G/GTGGGSNP12C/CTC—CSNP13A/AGAAASNP单体型结果红色字体，携带者单体型胚胎检测结果样本名称非整倍体检测结果致病位点及SNP检测结果汇总LTHJE1_146,XN不携带父源突变LTHJE2_146,XN携带父源突变绿色底纹，正常胚胎胚胎检测结果疾病分类病种基因疾病分类病种基因疾病分类病种基因代谢及免疫系统（19种）慢性肉芽肿CYBB血液系统疾病（10种）α地中海贫血HBA神经系统疾病（15种）VB6依赖性癫痫ALDH7A1神经节苷脂沉积症GLB1甲型血友病F8脆性X染色体综合症FMR1生物素酶缺乏症BTD噬血细胞综合症PRF1MentalretardationPUS3眼皮肤白化病TYR糖原累积症GAA亨廷顿舞蹈症HTT/IT15重症免疫缺陷病IL2RG糖原贮积症ⅣGBE1脊髓小脑共济失调SCA2,SCA3II型黏多糖贮积症IDS血小板无力症ITGA2B脊髓性肌萎缩症SMN1苯丙酮尿症PAH血小板增多JAK2脊髓延髓肌肉萎缩症/SBMAAR低碱性磷酸血症ALPL血友病F9结节性硬化症TSC2枫糖尿病BCKDHA遗传性球形红细胞增多症ANK1佩梅病PLP1肝豆状核变性ATP7B遗传性脱水口形红细胞增多症PIEZO1遗传性肌病LAMA2戈谢病GBA遗传性肿瘤（9种）II型神经纤维瘤NF2异染性脑白质营养不良ARSA甲基丙二酸血症HCFC1,MMACHC,MMADHC,MUTI型神经纤维瘤NF1婴儿型神经元蜡样质脂褐质沉积症PPT1精氨酰琥珀酸尿症ASL多发性骨软骨瘤EXT1Dandy-walker/先天性肌营养不良POMT1卡尔曼综合征PROKR2范可尼贫血FANCA腓骨肌萎缩症PMP22黏多糖贮积症Iva型GALNS黑斑息肉综合征STK11腓骨肌萎缩症2A型MFN2家族性甲状腺髓样癌综合征RET泌尿系统疾病（2种）常染色体显性遗传性多囊肾PKD1，PKD2严重联合免疫缺陷IL7R先天性类脂性肾上腺增生STAR遗传性多发性骨软骨瘤EXT2常染色体隐性遗传性多囊肾PKHD1先天性肾上腺皮质增生CYP21A2Birt-Hogg-Dubé综合征FLCN皮肤系统疾病（1种）营养不良型大疱性表皮松解症COL7A1高血脂症ABCG5痣样基底细胞癌综合征PTCH1五官系统疾病（6种）胎儿唇腭裂