滨海湿地生态系统微生物驱动的氮循环研究进展杨雪琴

微生物学报ActaMicrobiologicaSinica2018,58(4):633-648:10.13343/j.cnki.wsxb.20170538MicrobiomeintheHydrosphereandRelatedElementalGeochemicalCycling水圈微生物–元素地球化学循环基金项目：中山大学“百人计划”(38000-18821107)；中山大学“千人计划”(38000-18821105)*通信作者。Tel：[phone]；E-mail：颜庆云，[e-mail]；贺志理，[e-mail]收稿日期：2017-11-05；修回日期：2017-12-29；网络出版日期：2018-01-18滨海湿地生态系统微生物驱动的氮循环研究进展杨雪琴，连英丽，颜庆云*，贺志理*中山大学环境科学与工程学院，环境微生物组学研究中心，广东广州510006摘要：滨海湿地生态系统介于陆地生态系统和海洋生态系统之间，其类型多种多样，环境差异极大，微生物种类丰富。近年来，随着人为氮源的大量输入，造成滨海湿地生态系统富营养化污染问题日趋严重。本文主要总结了滨海湿地生态系统微生物驱动的固氮、硝化、反硝化、厌氧氨氧化、3NO还原成铵等主要氮循环过程，并综述了通过功能基因(如nifH、amoA、hzo、nirS、nirK、nrfA)检测微生物群落多样性及其环境影响因素的相关研究，旨在更好理解微生物驱动氮循环过程以去除氮，以期为减轻富营养化和危害性藻类爆发提供科学依据。关键词：滨海湿地生态系统，氮循环，固氮，硝化，反硝化，厌氧氨氧化，3NO还原成铵滨海湿地生态系统处于陆地和海洋之间，是指大陆架区域的潮间带和潮下带(水深不超过200m)，包括常被海水淹没的区域和海岸线100km内的毗邻地。典型的滨海湿地生态系统包括河口、沙滨、红树林、海草等[1]。它们兼具水生和陆生生态系统特征，是一类生物多样性丰富、生产力高、生态服务价值大的生态系统[2–3]。滨海湿地生态系统不仅具有水文防洪功能，同时还能为鱼类和其他野生动物提供栖息场所[4]。滨海湿地生态系统水深较浅，底泥易形成缺氧环境，是发生氧化还原反应的主要场所。随着沿海城市经济的迅速发展，人类活动日渐频繁，滨海湿地的纳污量也随之急剧增加。在过去的30多年的时间里由长江汇入东海的可溶性无机氮增加了3倍多[5]。可溶性无机氮进入海洋后，一方面导致海岸带氮超载水质变差、富营养化[6]，出现如波罗的湾、墨西哥湾、切萨皮克湾一样的“死区”[7]；另一方面影响生态位及物种多样性[8]。因此了解氮循环过程以及与之相关的微生物作用机理对滨海湿地生态系统具有重要意义。微生物是生物地球化学循环的主要驱动者，也是地球生态平衡的重要维持者。滨海湿地生态系统具有的典型生态功能与该生境下微生物的群落组成及代谢网络息息相关。近年来新型生物学634XueqinYangetal.|ActaMicrobiologicaSinica,2018,58(4)[e-mail]技术的出现以及不断更新的数据分析方法，使科学家们可以更为深入全面地认识环境微生物群落组成和功能结构，为揭示微生物在生态系统中的重要作用提供了有力的工具。基因芯片和高通量测序是最具代表性的宏基因组学技术，其中基因芯片技术具有方便快捷、精确稳定的特点，可检测包括碳(C)、氮(N)、磷(P)、硫(S)循环、金属还原和抗性、抗生素降解、有机物降解等不同的功能基因[9–13]，目前更新到GeoChip5.0，包含167000个寡核苷酸探针，15904个功能基因，可以原位检测微生物群落功能结构和代谢功能；本课题组利用基因芯片研究了滨海湿地生态系统微生物功能菌群[14]，南极生态系统的碳、氮循环[15]，陆地生态系统[16]、草地生态系统[10]、大豆农田生态系统[11]氮循环基因及微生物群落在CO2升高后的变化，原位添加3NO后氮循环基因及微生物群落结构和多样性的变化[17]等；高通量测序技术具有全面精准、挖掘新基因和新代谢途径等优点，为未知基因的检测提供了可能。目前关于滨海湿地生态系统微生物功能的分子生态学研究主要是针对C、N、S、P、重金属等物质循环过程，其中氮循环主要包括固氮、硝化、反硝化、厌氧氨氧化等过程(图1)。图1.氮循环过程及其关键功能基因[10]Figure1.Thenitrogencycleandinvolvedkeyfunctionalgenes[10].本文将主要综述滨海湿地生态系统中微生物作用下氮循环的主要氧化还原过程、微生物群落结构、功能特性以及与之相关的环境因子。1微生物固氮微生物固氮是指将气态N2转化为4NH的过程，常用功能基因nifH研究固氮过程，因其较为保守，且已知的基因序列非常丰富[18]。根据nifH进行系统发育树分析，可以将固氮微生物分为5个主要的类群(ClustersI–V)，其中滨海湿地生态系统中最常见的固氮菌主要属于ClustersI和ClustersⅢ[18–19]。ClustersI包括蓝细菌/蓝藻(Cyanobacteria)、大部分α-,β-,γ-,δ-变形菌(Proteobacteria)、厚壁菌门(Firmicutes)等多个类群，ClustersⅢ主要包括古菌和厌氧细菌，如梭菌(Clostridia)、产甲烷菌(Methanogens)、硫酸盐还原菌(Sulfate-reducingbacteria)等。学者通过测定固氮速率估算微生物固氮在滨海湿地生态系统中的贡献量，发现滨海湿地生态系统中的氮排入和氮损失失衡。如Fitzroy河口的固氮速率为0.99–1.09μmolN/(m2·h)[20]，位置(上游、中部、下游)和季节对其影响不大；LittleLagoon固氮速率相对较高，为1.6–2.6μmolN/(m2·h)[21]。Short和Zehr[22]在研究ChesapeakeBay地区时检测到较高的nifH基因多样性，但表达的nifH基因只有两种，且都为蓝细菌型。在2011年Sohm等[23]综述了蓝藻型固氮微生物(如Trichodesmium)固氮作用，并提出异养型固氮微生物的作用还有待研究。Zhou等[24]认为原来的微生物固氮研究局限于水体，基于nifH基因检测沉积物中异养型微生物丰度占总丰度的0.36%–14.95%，并指出沉积物中异养型微生物固氮作用不可忽视。目前已报道的杨雪琴等|微生物学报,2018,58(4)635微生物固氮速率仍然较低，有可能是外源性氮排入对滨海湿地生态系统固氮过程的抑制，具体的还有待进一步研究。研究发现在河口地区，由于沉降作用、流域水文条件和环境选择压力(如盐度、温度、pH等)改变，沿着河头到河嘴再到近海区域的固氮菌皆有所不同[19,25–26]。Thajudeen等[27]在Cochin河口观察到固氮菌的多样性较高，其中γ-变形菌为优势菌，并指出其固氮速率与K+、Fe2+、总有机碳(TOC)、总氮(TN)、粘土含量为负相关关系。2微生物硝化过程2.1分步硝化过程与完全硝化过程硝化过程指氨氧化为3NO的过程。一个世纪以来，学者们普遍认为硝化过程需分步完成，即包括氨氧化为2NO和2NO氧化为3NO两个过程，且分别由两类微生物执行，直到2015年vanKessel等[28]在富集氮循环微生物时发现CandidatusNitrospiranitrosa和CandidatusNitrospiranitrificans能执行完整的硝化过程，即完全硝化过程(completeammoniaoxidation，Comammox)，同年Daims等[29]在石油勘测井的管壁上富集到中度噬热菌CandidatusNitrospirainopinata可将4NH等摩尔地氧化为3NO，Pinto等[30]在饮用水中发现了类似的Nitrospira，这些发现一方面证实了Comammox理论存在的猜测[28–29]，另一方面引起了学者对其生态位、在硝化过程中的贡献等氮循环相关问题的广泛关注。近两年有关全程硝化菌的生态生理学研究陆续发表，有研究提到Nitrospirainopinata对4NH有更强的亲和力，在低浓度4NH下能缓慢生长[31]，适应于贫营养环境，这些研究为滨海湿地系统相关研究提供了重要的理论基础。下文综述的内容主要为分步硝化过程。分步硝化过程中氨氧化过程是限速步骤[32]。基因amoA编码的氨单加氧酶(amo)是催化第一步氨氧化反应的关键酶。利用amoA可以分析不同环境中氨氧化效率、功能微生物的群落结构及生物多样性等。能执行氨氧化过程的细菌有氨氧化细菌(ammoniaoxidizingbacteria，AOB)和氨氧化古菌(ammoniaoxidizingarchaea，AOA)。人们在很长一段时间里认为只有氨氧化细菌能进行氨氧化，直到2004年科学家在研究海洋基因组学时发现泉古菌具有与细菌相近的amoA基因，随后通过基因转录的方法间接证明了氨氧化古菌也具有氨氧化功能[33–34]；通过宏基因组测序的方法，在Cenarchaeumsymbiosum的基因组序列中发现与二氧化碳固定相关的基因，同时这些基因也是TCA循环过程的必需基因，推测该菌可能是混合营养型[35]，这对碳、氮循环有着重要的意义。2.2滨海湿地生态系统中AOA、AOB的丰度及其多样性滨海湿地生态系统中主要的AOA菌属有Nitrosopumilus、Nitrosophsera、Nitrosocaldus、Nitrosotalea。AOB则主要包括β-变形菌纲的亚硝化单胞菌(Nitrosomonas)与亚硝化螺菌属(Nitrosospira)以及γ-变形菌纲的亚硝化球菌属(Nitrosococcus)[36]。滨海红树林中的AOA的丰度总是高于AOB，就不同红树植物而言，土著红树林的AOA丰度相比于入侵的互花米草型红树林高约100倍，这与其他研究相符[35,37–39]。相反的研究也有，Wang和Gu[40]发现香港滨海湿地生态系统中AOB的amoA丰度占84%–92%，高于AOA636XueqinYangetal.|ActaMicrobiologicaSinica,2018,58(4)[e-mail]的amoA丰度；Li等[41]和Han等[42]也发现同样的结果。也有研究表明虽然在农耕土壤中AOA的丰度高于AOB[43]，但是AOB对氨氧化的贡献更大[44]。Cao等[37]的研究表明红树林AOB多样性高于AOA，以互花米草型红树林和本土红树林AOB生物多样性无明显变化，而互花米草型AOA生物多样性高于本土红树林[45]。这些研究结果表明，滨海湿地生态系统中AOA、AOB的丰度以及其相互关系还需要更多深入的研究来揭示。2.3影响AOA和AOB群落的环境因子Han等[42]利用基因芯片GeoChip4.0检测不同红树林的amoA，发现互花米草、桐花树、秋茄、白骨壤红树林之间的氨氧化功能有显著差异。Wang和Gu[40]研究发现芦苇和莎草对AOB的群落结构有影响，对AOA基本无影响。在淡水中β-AOB丰度显著低于海水的，AOA的丰度基本保持不变[46]。2012年Cao等[47]进一步研究发现从珠江口湿地到东海，β-变形菌纲的优势种由Nitrosomonas变为Nitrosospira，表明盐度和人类活动对AOA和AOB的影响较大。除受盐度和人类活动的影响，滨海湿地生态系统AOA和AOB的相对丰度还受4NH、pH、24SO、重金属和有机物等的影响[39]。AOA和4NH有较高的亲和力，在低4NH的情况下具有很强的竞争力；AOA还倾向于较低pH[35,37,39,48–49]。综上，AOA比AOB在极端条件或者贫营养环境中更具有生存