产微生物絮凝剂菌种的筛选赵祥颖

-43-ShandongFoodFermentation2009.2(总第153期）山东食品发酵科研生产微生物絮凝剂是一类天然高分子絮凝剂，是利用生物技术，从微生物菌体体或其分泌物中提取、纯化而获得的一种能自然降解的新型絮凝剂。与无机或有机高分子絮凝剂相比，微生物絮凝剂具高效、安全、适用范围广等的特征。微生物絮凝剂的特性和优势为水处理技术的发展展示了一个广阔的前景。产生絮凝剂的微生物来源广泛，种类繁多，本文采用通过测定发酵液对高岭土悬浊液的絮凝性的大小，从污水处理设施或城市下水道污水中分离筛选具有应用前景的絮凝剂的生产菌株。1材料与方法1.1材料1.1.1分离材料取自啤酒厂、淀粉厂、印染厂、城市下水道等的16份污水或污泥样品。1.1.2培养基富集培养基（g/L）：牛肉膏3，蛋白10，NaCl5，苯酚0.4，琼脂18，pH7.0-7.2平板分离培养基(g/L)：牛肉膏3，蛋白10，NaCl5，苯酚0.4，制霉素片0.4，琼脂18，pH7.0-7.2斜面培养基（g/L）：牛肉膏3，蛋白10，NaCl5，琼脂18，pH7.0-7.2液体种子培养基（g/L）：牛肉膏3，蛋白10，NaCl5、苯酚0.4，pH7.0-7.2发酵培养基（g/L）：葡萄糖20，磷酸氢二钾5，磷酸二氢钾2，NaCl0.1，硫酸0.2，尿素0.5，酵母膏0.5，硫酸镁0.2，pH8.01.2方法1.2.1平板分离取1g或1ml分离材料于富集培养基中，30℃振荡培养12、24、48、60h后，适当稀释涂布于分离平板上，30℃培养1-2天，观察菌落生长情况，挑取粘稠菌落移接斜面，30℃培养2-3天取出备用。1.2.2摇床初筛以一株接一瓶的方式进行摇瓶发酵初筛，摇瓶装液量为30mL/250mL三角瓶，30℃，180r/min，培养3天，发酵结束后，取0.5mL发酵液加入到装有10mL4g/L高岭土悬浊液的25mL比色管中，同时加入0.5mL1%CaCl2的溶液，充分振荡，静置1min，观察有无大块絮花产生，以未接种液体培养基代替发酵液作空白对照。1.2.3摇床复筛以一株接三瓶的方式进行摇瓶发酵复筛，摇瓶装液量为30mL/250mL三角瓶，30℃，180r/min，培养3天，然后测定发酵液的絮凝性。1.2.4絮凝率的测定首先在比色管中加入20mL4g/L高岭土悬浊液和0.5mL1%CaCl2的溶液，然后加0.5mL发酵液，将比色管上下颠倒10次，慢速颠倒10次，静置15min。用未接种液体培养基代替发酵液作空白对照，取上清液用分光度计测定在550nm处的吸光度，按下式计算絮凝率E絮凝率（%）=(A﹣B)/A×100%其中：A为空白对照在550nm处的吸光度B为发酵菌液在550nm处的吸光度2结果与分析2.1产絮凝剂菌株初筛从16份分离材料经富集培养平板分离培养，共挑取菌株652株，通过摇瓶初筛共得到86株具有絮凝性的菌株。结果见表1。产微生物絮凝剂菌种的筛选（1山东省食品发酵工业研究设计院山东济南250013）（2山东农业大学山东泰安271000）赵祥颖1杨玉静2田延军1刘春生1刘建军1，2-44-ShandongFoodFermentation山东食品发酵2009.2(总第153期）科研生产表1初筛结果序号样品来源挑取菌株数有絮凝性菌株数1啤酒厂污泥14532啤酒厂污泥23613啤酒厂厌氧罐12624啤酒厂厌氧罐21805淀粉厂厌氧池1126236淀粉厂厌氧池256127淀粉厂好氧池14338淀粉厂好氧池242189淀粉厂污泥135510淀粉厂污泥2871211印染厂污水125012印染厂污泥232113城市下水道污水128114城市下水道污水115115城市下水道污泥138416城市下水道污泥1452初筛结果表明，来自淀粉厂的污水处理样品，筛选到的具有絮凝性的菌株比较多，其他样品具有絮凝特性的菌株比例较小。图1为具有絮凝特性菌株高岭土絮凝效果（将发酵液加入到高岭土悬浊液中，具有絮凝性的菌株产生颗粒状沉淀，悬浊液变澄清）。图1产絮凝剂菌株的筛选2.2产絮凝剂菌株复筛将初筛获得的86株具有絮凝活性的菌株，一株接三瓶，进行摇瓶发酵，发酵结束后测定发酵液的絮凝率。部分复筛结果见表2。表2菌种复筛结果菌株编号絮凝率（%）菌株编号絮凝率（%）1-338.236.145.16-2665.953.863.52-842.139.444.56-5445.943.853.53-1026.922.121.97-253.344.847.33-1825.123.931.68-242.943.951.45-131.936.938.48-432.543.141.75-755.159.456.78-1542.638.341.35-1245.449.646.18-3628.132.323.35-1545.139.444.59-142.943.951.45-1242.148.341.79-432.138.341.55-2338.138.333.79-2638.532.336.55-3558.762.157.19-3135.342.943.95-8143.148.643.710-937.237.228.16-538.148.343.710-1326.922.131.96-1653.345.251.310-4537.237.228.16-1852.158.351.713-536.632.127.96-2170.675.174.015-535.239.248.1通过摇瓶发酵复筛，发现初筛菌株絮凝特性不太稳定，部分菌株絮凝性质减弱或消失，通过两轮筛选，筛选出4株絮凝特性较高且比较稳定的菌株，又进行了三次发酵试验结果见表3。表3菌株复筛结果复筛次数菌株编号絮凝率（%）12345平均值%一次复筛5-758.256.165.159.454.758.75-3556.455.652.644.755.653.06-2170.665.164.062.564.765.46-2646.248.948.849.640.646.8二次复筛5-746.942.151.956.958.451.45-3550.739.453.355.256.351.06-2168.771.870.771.276.871.86-2653.344.857.357.155.853.7三次复筛5-737.237.238.148.343.740.95-3556.853.158.756.157.156.46-2161.069.466.669.668.069.26-2635.342.943.951.443.043.3-45-ShandongFoodFermentation2009.2(总第153期）山东食品发酵科研生产通过多轮复筛，发现菌株6-21，絮凝活性较高，并且稳定。本文选择6-21菌株作为进一步研究的出发菌株。2.3菌株6-21的培养特性菌株6-21为细菌，杆状（0.4-0.6×1.0-1.5um，如图2），革兰氏染色阴性，最适生长温度为30℃。在分离培养基上，30℃培养3天，菌落呈乳白色，菌落圆形，边缘整齐，表面光滑（如图3）。在液体种子培养基中培养，6小时进入对数期，18-20小时进入稳定期（见图4），说明菌株6-21在该培养基中生长较好。图4菌株6-21的生长曲线2.4菌株6-21絮凝活性分布收集菌株6-21发酵液，4000转离心，分别测定发酵液、上清液和菌体悬液的絮凝活性，结果见图5。图5菌株6-21的絮凝活性分布从试验结果可以看出，上清液与空白培养基对照相比，絮凝活性增加甚微，而菌体悬液却表现出较高的絮凝活性，说明菌株6-21产生的絮凝活性的成分主要存在于菌体沉淀中。然而这种具有絮凝活性的物质是粘附于细胞表面，还是细胞表面的组成成分，还有待进一步研究确定。另外，研究还发现发酵液（不去菌体）的絮凝率也比菌体悬液的低,这可能是发酵液中的某些成分干扰了菌体对测定体系絮凝的活性造成的。2.5菌株6-21发酵液对印染废水的絮凝效果印染废水主要污染物为各种的印染助剂，且具强碱性，因此，可生化性较差，一般厌氧好氧污水处理工艺对其处理效果较差，COD去除率图2菌株6-21的菌体形态（单染色）图3菌株6-21的菌落形态-46-ShandongFoodFermentation山东食品发酵2009.2(总第153期）科研生产低。本研究尝试将菌株6-21发酵液，直接添加到印染企业综合污水中，考查其对污水的脱色絮凝效果，结果如图6。图6菌株6-21发酵液对印染污水的处理效果结果表明，菌株6-21产生的絮凝物质对印染废水具有较好的絮凝效果，COD去除率达60%以上，具有较好的研究价值及应用前景。3结论与展望本文从啤酒厂、淀粉生产企业、印染厂等污水处理设施和城市下水道中共取样16份，通过平板分离摇瓶初筛和复筛，筛选到4株絮凝活性比较高的菌株，通过进一步筛选、比较，最后选取一株絮凝活性较高，絮凝性稳定的菌株6-21作为进一步研究的对象。菌株6-21为细菌，最适生长温度为30℃，在种子培养基中生长良好。菌株6-21的絮凝活性主要存在于菌体上，具体成分有待进一步分析。菌株6-21发酵液对印染污水具有较好的絮凝效果，具有较高的COD去除率，今后可在这个方面开展进一步的研究工作。信息快递国家认证认可监督管理委员会、工业和信息化部与黑龙江省人民政府在哈尔滨市共同签署合作备忘录。三方通过建立紧密合作机制，在黑龙江省开展以乳制品生产企业良好生产规范（ＧＭＰ）、危害分析与关键控制点（ＨＡＣＣＰ）体系认证试点示范工作。据国家认监委负责人介绍，该试点是我国首个针对乳制品生产企业危害分析与关键控制点体系认证的试点。该试点旨在提升乳制品质量安全保障水平，促进乳业振兴和发展。近年来，我国食品质量安全状况总体上有了明显改善，但时有发生的食品质量安全事件仍使食品生产企业、各级政府部门和社会各界面临严峻挑战。黑龙江省是我国乳业大省，乳制品生产企业数量约占全国９％，乳制品产量约占全国１０％。乳业资源、产业优势和监管基础良好，自然资源得天独厚。全国多家大型乳制品企业在黑龙江省均有奶源基地。该项试点工作将联合确定试点示范乳制品生产企业，建立企业发展公共技术服务平台，对产品质量进行跟踪监测，并向企业提供良好生产规范企业、危害分析与关键控制点、诚信体系、食品防护等方面的法规、政策、技术和标准支持；在乳业集中区域，由地方政府牵头，开展乳制品质量安全区域化建设试点工作，并以此为基础逐步在其他食品生产企业、区域进行推广；联合监管部门、行业组织、科研院所等部门开展乳制品非传统食品安全风险分析与预警研究工作。据了解，乳制品良好生产规范（ＧＭＰ）与危害分析与关键控制点体系（ＨＡＣＣＰ）适时出台实施，能够从技术创新、产品研发、原料采购、生产制造、储运销售等全员、全过程、全方位完善现有的管理体系，给现有的食品安全管理体系打上“食品防护补丁”，建立区域预警、监控、纠正体系，完善质量安全追溯，使乳制品企业预防非传统食品安全危害的水平能够得到一个很大的提升。我国启动乳品企业危害分析与关键控制点体系认证