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微生物学通报APR20,2010,37(4):566572MicrobiologyChina©2010byInstituteofMicrobiology,CAStongbao@im.ac.cn基金项目:浙江省科技计划项目(No.2007C22032);浙江省农业科学院创新提升工程项目*通讯作者:Tel:86-27-87281040;:gxy@mail.hzau.edu.cn收稿日期:2009-01-22;接受日期:2010-02-09研究报告城市河道污水中好氧反硝化菌的分离鉴定与特性詹吉东1,2汤江武2王新2姚晓红2吴逸飞2周莉1葛向阳1*(1.华中农业大学生命科学与技术学院湖北武汉430070)(2.浙江省农业科学院植物保护与微生物研究所浙江杭州310021)摘要:采用富集培养和BTB(溴百里酚蓝)平板法从城市河道污水中筛选、分离获得了一株高效的好氧反硝化菌株ADZ1,48h内对硝酸盐的降解率为93.1%,总氮的去除率为34.7%。16SrRNA测序及系统发育分析结果表明该菌株属于Pseudamonassp.,经VITEK®2系统鉴定为Pseudomonasputida。对该菌株的反硝化特性进行了研究,结果表明,该菌株以乙醇为最佳碳源,在碳氮比达到12:1时,对硝酸盐的去除率达到98%以上,总氮去除率达到41.3%。该菌株对溶解氧、pH有着广泛的适应性,菌体活力强,有着良好的应用前景。关键词:好氧反硝化,城市河道,生物脱氮,恶臭假单胞菌(Pseudomonasputida)IsolationandCharacterizationofAerobicDenitrifierfromtheSewageofUrbanRiversZHANJi-Dong1,2TANGJiang-Wu2WANGXin2YAOXiao-Hong2WUYi-Fei2ZHOULi1GEXiang-Yang1*(1.CollegeofLifeScienceandTechnology,HuazhongAgriculturalUniversity,Wuhan,Hubei430070,China)(2.InstituteofPlantProtectionandMicrobiology,ZhejiangAcademyofAgriculturalScience,Hangzhou,Zhejiang310021,China)Abstract:AbacterialstrainADZ1thatdemonstratedhigherefficientintheaerobicdenitrificationwasiso-latedfromthesewageofurbanriversontheselectivemedium,BromothymolBlue(BTB),afterenrichedintheshakingflasks.Thereductionefficiencyfornitrateandthetotalnitrogenreached93.1%and34.7%within48hoursrespectively.Sequenceof16SrRNAsuggestedthatstrainADZ1belongstothegenusofPseudamonas,andfurtherwasidentifiedasPseudomonasputidabyVITEK®2systems.WiththegrowthconditionsthattheethanolservedasthecarbonsourceandC/Nratiowas12:1,theefficiencyfornitrateandthetotalnitrogenreductionreached98%and41.3%respectively.DuetothebroadadaptabilitytodissolvedoxygenandpH,togetherwiththehighactivityforaerobicdenitrification,thisstrainshowedthepotentialapplicationinthefuture.Keywords:Aerobicdenitrification,Urbanriver,Biologicaldenitrification,Pseudomonasputida詹吉东等:城市河道污水中好氧反硝化菌的分离鉴定与特性567氮素是我国水体污染和富营养化的主要因素之一,生物脱氮技术因其经济、有效、易操作、无二次污染等特点成为研究的热点问题之一。传统理论认为,水中氮素的去除是将氨氧化形成的硝酸盐氮在缺氧的条件下被反硝化菌类还原为氮气和N2O,即必须通过好氧硝化、缺氧反硝化这两个相对独立的过程。好氧反硝化现象在20世纪50年代被发现[12],1988年Robertson[3]在除硫和反硝化处理系统出水中首次分离出好氧反硝化泛养副球菌(Paracoccuspantotropha)、假单胞菌属的某一种(Pseudomonasspp.)和粪产碱菌(Alcaligenesfaecalis)等,使得硝化反硝化过程在同一个反应器中同时进行成为可能。这不仅节约了投资和运行成本,缩短脱氮周期,而且反硝化释放的碱可以补偿硝化反应消耗的碱,这对突破当前生物脱氮技术面临的困境,深入研究和发展生物脱氮工艺具有重要意义。好氧反硝化功能菌的研究因而受到广泛的重视,我国研究人员也开展了一些研究,发现了不同类型的好氧反硝化细菌[410]。好氧反硝化菌在不同生境中通常不是优势菌,并且反硝化能力存在差异,从不同环境中获得高效的功能菌株并使其在反应体系中成为优势种群而发挥反硝化作用仍是很有意义的工作。本文介绍了一株从城市河道污水中分离获得的一株好氧反硝化菌,并对其在不同条件下的好氧反硝化活性进行了探讨。1材料和方法1.1好氧反硝化菌的富集和筛选从杭州市郊河道及京杭运河采集水样,混合后按5%的接种量,接入富集培养基[11](柠檬酸钠9.63g,硝酸钠0.85g,磷酸二氢钾1.36g,硫酸铵0.27g,酵母提取物1g,硫酸镁0.19g,微量元素1mL,去离子水1L,pH7.3,1×105Pa灭菌30min)中,180r/min、30°C培养富集,3d后取5mL的富集培养液到新的富集培养基中继续培养,重复3次。将富集好的培养液稀释104、105,涂布在BTB(溴百里酚蓝)平板上[硝酸钾1g,L-天冬酰胺1g,磷酸二氢钾1g,氯化亚铁0.05g,氯化钙0.2g,硫酸镁1g,BTB1mL(1%溶于酒精),琼脂20g,去离子水1L,pH7.3,1×105Pa灭菌30min][12],待菌落长出后挑取蓝色和具有蓝色晕圈的单菌落再在BTB平板上划线纯化作为初筛菌株。以硝酸钾为唯一氮源,筛选反硝化活性最高的菌株,培养基为:葡萄糖0.5g,乙酸钠0.35g,磷酸二氢钾0.105g,硝酸钾0.05g。在180r/min、30°C条件下培养48h。1.2分离菌株16SrRNA测序、系统发育分析和鉴定1.2.1分离菌株的16SrRNA测序:经分离纯化后获得一株具有较高反硝化活性的菌株,命名为ADZ1。用LB培养基(蛋白胨10g,酵母提取物5g,NaCl10g,去离子水1L,pH7.3,1×105Pa灭菌30min)培养ADZ1,采用BiospinBacteriaGenomicDNAEx-tractionKit(BioerTechonlogyCo.Ltd)提取基因组DNA,以提取获得的基因组DNA为模板,扩增16SrRNA片段。16SrRNA的引物1序列[13]为:5′-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3′(E.colibases8to27),引物2序列[13]为:5-TACCTTGTTACGACTT-3(E.colibases1507to1492)。PCR扩增体系为25μL,包括:10×PCRBuffer2.5μL(含有15mmol/L的Mg2+),dNTPs(10mmol/L)0.5μL,引物1、2(10μmol/L)各0.4μL,BSA(牛血清白蛋白)(1g/L)1μL,DNA模板约30ng,ExTaqDNA聚合酶0.75U,用ddH2O补至25μL。反应条件:95°C4min;94°C1min,55°C1min,72°C1.5min,30个循环;72°C8min。PCR产物用1%的琼脂糖凝胶电泳检测。采用PCR胶回收试剂盒回收纯化1.5kb左右的目的片段,纯化回收的PCR产物送交上海Invitrogen生命技术有限公司测序。1.2.2系统发育分析:分离获得的菌株ADZ1的测序结果在GenBank中进行序列同源性比较,通过BIOEDIT7.0和MEGA4.0等软件进行多重序列比对分析,并以Neighbor-joining法构建系统发育树[14]。1.2.3菌株的鉴定:采用法国bioMerieux公司的VITEK®2细菌鉴定系统对ADZ1进行鉴定,使用VITEK®2GN卡,依据该设备提供的操作程序鉴定菌株ADZ1。1.3不同碳源和碳氮比对菌株反硝化活性的影响为测定目标菌株在不同碳源条件下对硝酸盐氮的降解情况,根据反硝化培养基[3]设计如下培养基:硝酸钾0.2g/L,磷酸二氢钾0.105g/L,微量元素2mL,碳源按照10:1的摩尔比加入,pH7.2,1×105Pa灭菌30min。用到的碳源为葡萄糖、柠檬酸568微生物学通报2010,Vol.37,No.4钠、蔗糖、乙醇、麦芽糖和乙醇,其中乙醇为灭菌后加入。经LB培养基活化后的菌体经离心后用无菌水重悬,反复3次后按1%的接种量加入含不同碳源的培养基中,140r/min、30°C条件下培养48h后测定硝酸盐氮降解率。以不加菌的各培养基为空白对照,在未加碳源的培养基中加入等量菌液以检测自养反硝化活性。每个处理重复两次,该实验重复3次。在确定最佳碳源的基础上,改变碳氮比,检测不同碳氮比对目标菌株反硝化活性的影响。1.4菌株的生长特性及其在不同条件下对硝酸盐的还原能力在最佳的碳源和最佳碳氮比条件下,采用1.3中相同的培养基,分别在投菌量103、104、105、106、107个/mL,pH5、pH6、pH7、pH8、pH9,厌氧(石蜡油封静止),静止,110、140、170、200r/min的条件下,测定目标菌株在不同投菌量、不同pH和不同溶氧条件下对硝酸盐的还原能力,每项实验重复3次。为检测目标菌株的生长曲线以及在生长过程中对硝酸盐氮的降解,对氨氮和亚硝酸盐氮的积累。在最佳碳源和最佳碳氮比的条件下,采用1.3中相同的培养基,配置48个三角瓶,每个三角瓶100mL,接种量1%,170r/min、30°C条件下培养。每2h取出2个三角瓶放入4°C冰箱,最后测定其中的硝酸盐氮,氨氮,亚硝酸盐氮以及OD600,每瓶取样3次测定,重复此实验2次。1.5分析方法实验过程中测定硝酸盐、亚硝酸盐、氨氮和总氮的含量均采用气相分子吸收光谱法,对应国家标准分别为HJ/T198-2005、HJ/T197-2005、HJ/T195-2005、HJ/T199-2005。2结果和讨论2.1分离菌株的测序和鉴定采用BTB平板法从经过富集培养后的样品中获得6株具有反硝化活性的菌株,对6株菌株的初步筛选结果表明ADZ1在48h内对硝酸盐的降解率为93.1%,总氮的去除率为34.7%。对菌株ADZ1进行了测序分析,获得了1420bp的16SrRNA序列,与GenBank数据库序列进行BLAST比对,并挑选6株与该菌株相似性达到99%的典型菌株序列,通过BIOEDIT7.0和MEGA4.0等软件进行多重序列比对分析后构建系统发育树(图1),结果表明该菌株属于Pseudamonassp.。采用法国BioMerieux公司的VITEK®2细菌鉴定系统对ADZ1进行鉴定,使用VITEK®2GN卡,检测AD
本文标题:城市河道污水中好氧反硝化菌的分离鉴定与特性
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