氮源对塔玛亚历山大藻生长和毒性的影响

氮源对塔玛亚历山大藻生长和毒性的影响司冉冉１　关万春１　蔡景波２　陈少波１∗（１温州医科大学生命科学学院海洋生物技术系，浙江温州３２５０３５；２浙江省海洋水产养殖研究所，浙江温州３２５００５）摘　要　为了掌握不同氮源对塔玛亚历山大藻（Ａｌｅｘａｎｄｒｉｕｍｔａｍａｒｅｎｓｅ）生长和毒性的影响，实验选定硝酸钠、氯化铵、尿素和甘氨酸作为４种氮源，在温度和光强分别为２０℃和２００μｍｏｌｐｈｏｔｏｎｓ·ｍ－２·ｓ－１的培养箱中，采用人工海水一次性培养藻细胞，培养基Ｎ和Ｐ浓度分别以Ｆ／２０加富，并收集对数期细胞用于斑马鱼胚胎４８ｈ急性毒理实验。结果表明：４种氮源都可以支持细胞生长，但不同氮源培养的藻细胞生长速率不同，表现为铵氮（０．２５ｄ－１）＞硝氮（０．２０ｄ－１）＞尿素＝甘氨酸（０．１２ｄ－１）；４种氮源对细胞色素的含量无显著影响；与对照组（胚胎培养液）相比，在细胞密度为２×１０４ｃｅｌｌｓ·ｍＬ－１时，塔玛亚历山大藻细胞粗提液对斑马鱼胚胎表现出显著的毒性作用，可造成胚胎的凝固、发育迟缓、卵黄膜破裂、卵黄囊水肿及尾巴弯曲等；当细胞密度增加到８×１０４ｃｅｌｌｓ·ｍＬ－１时，毒性进一步增加，且４种氮源对毒性的影响出现显著差异，表现为硝氮＞尿素＝甘氨酸＞铵氮。综上所述，塔玛亚历山大藻的生长和毒性对氮源的响应机制存在差异，但４种氮源都支持生长，因此，在环境变化和水体营养盐结构复杂化的情况下，塔玛亚历山大藻仍可维持生长并持续爆发藻华，对生态环境造成威胁。关键词　塔玛亚历山大藻；生长；氮源；毒理；斑马鱼ＥｆｆｅｃｔｓｏｆｎｉｔｒｏｇｅｎｓｏｕｒｃｅｓｏｎｔｈｅｇｒｏｗｔｈａｎｄｔｏｘｉｃｉｔｙｏｆＡｌｅｘａｎｄｒｉｕｍｔａｍａｒｅｎｓｅ．ＳＩＲａｎ⁃ｒａｎ１，ＧＵＡＮＷａｎ⁃ｃｈｕｎ１，ＣＡＩＪｉｎｇ⁃ｂｏ２，ＣＨＥＮＳｈａｏ⁃ｂｏ１∗（１ＤｅｐａｒｔｍｅｎｔｏｆＭａｒｉｎｅＢｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏ⁃ｇｙ，ＳｃｈｏｏｌｏｆＬｉｆｅＳｃｉｅｎｃｅ，ＷｅｎｚｈｏｕＭｅｄｉｃａｌＵｎｉｖｅｒｓｉｔｙ，Ｗｅｎｚｈｏｕ３２５０３５，Ｚｈｅｊｉａｎｇ，Ｃｈｉｎａ；２ＺｈｅｊｉａｎｇＭａｒｉｃｕｌｔｕｒｅＲｅｓｅａｒｃｈＩｎｓｔｉｔｕｔｅ，Ｗｅｎｚｈｏｕ３２５００５，Ｚｈｅｊｉａｎｇ，Ｃｈｉｎａ）．Ａｂｓｔｒａｃｔ：ＩｎｏｒｄｅｒｔｏｕｎｄｅｒｓｔａｎｄｔｈｅｅｆｆｅｃｔｏｆｎｉｔｒｏｇｅｎｓｏｕｒｃｅｓｏｎｔｈｅｇｒｏｗｔｈａｎｄｔｏｘｉｃｉｔｙｏｆｈａｒｍｆｕｌｄｉｎｏｆｌａｇｅｌｌａｔｅＡｌｅｘａｎｄｒｉｕｍｔａｍａｒｅｎｓｅ，ｆｏｕｒｎｉｔｒｏｇｅｎｓｏｕｒｃｅｓ（ｎｉｔｒａｔｅ，ａｍｍｏｎｉｕｍ，ｕｒｅａａｎｄｇｌｙｃｉｎｅ）ｗｅｒｅａｄｄｅｄｉｎｔｏａｒｔｉｆｉｃｉａｌｓｅａｗａｔｅｒｅｎｒｉｃｈｅｄｗｉｔｈＦ／２０ａｎｄｃｅｌｌｓｗｅｒｅｂａｔｃｈ⁃ｃｕｌｔｕｒｅｄａｔ２０ｏＣａｎｄ２００μｍｏｌｐｈｏｔｏｎｓ·ｍ－２·ｓ－１．ＣｅｌｌｓｏｆＡ．ｔａｍａｒｅｎｓｅａｔｅｘｐｏｎｅｎｔｉａｌｐｈａｓｅｗｅｒｅｃｏｌ⁃ｌｅｃｔｅｄｔｏｔｅｓｔｔｈｅａｃｕｔｅｔｏｘｉｃｅｆｆｅｃｔｏｎｚｅｂｒａｆｉｓｈｅｍｂｒｙｏｉｎ４８ｈｏｕｒｓ．ＴｈｅｒｅｓｕｌｔｓｓｈｏｗｅｄｔｈａｔｆｏｕｒｎｉｔｒｏｇｅｎｓｏｕｒｃｅｓｗｅｒｅａｌｌｕｔｉｌｉｚｅｄｂｙＡ．ｔａｍａｒｅｎｓｅ，ｂｕｔｔｈｅｇｒｏｗｔｈｒａｔｅｗａｓｄｉｆｆｅｒｅｎｔ，ｂｅｉｎｇａｍｍｏ⁃ｎｉｕｍ（０．２５ｄ－１）＞ｎｉｔｒａｔｅ（０．２０ｄ－１）＞ｕｒｅａ＝ｇｌｙｃｉｎｅ（０．１２ｄ－１）．Ｈｏｗｅｖｅｒ，ｔｈｅｐｉｇｍｅｎｔｃｏｎ⁃ｔｅｎｔｓｗｅｒｅｎｏｔｉｎｆｌｕｅｎｃｅｄ．Ｃｏｍｐａｒｅｄｗｉｔｈｔｈｅｃｏｎｔｒｏｌｇｒｏｕｐ（ｅｍｂｒｙｏｍｅｄｉｕｍ），ｔｈｅｒｕｄｅｅｘｔｒａｃｔｏｆＡ．ｔａｍａｒｅｎｓｅａｔ２×１０４ｃｅｌｌｓ·ｍＬ－１ｈａｄｓｉｇｎｉｆｉｃａｎｔｌｙｔｅｒａｔｏｇｅｎｉｃｅｆｆｅｃｔｓｏｎｔｈｅｚｅｂｒａｆｉｓｈｅｍｂｒｙ⁃ｏｓ，ｒｅｓｕｌｔｉｎｇｉｎｅｍｂｒｙｏｃｏａｇｕｌａｔｉｏｎ，ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔａｌｒｅｔａｒｄａｔｉｏｎ，ｖｉｔｅｌｌｉｎｅｍｅｍｂｒａｎｅｒｕｐｔｕｒｅ，ｙｏｌｋｓａｃｅｄｅｍａａｎｄｔａｉｌｂｅｎｄｉｎｇ．Ｗｈｅｎｔｈｅｃｅｌｌｄｅｎｓｉｔｙｉｎｃｒｅａｓｅｄｔｏ８×１０４ｃｅｌｌｓ·ｍＬ－１，ｔｈｅｔｏｘｉｃｉｔｙｉｎｃｒｅａｓｅｄａｃｃｏｒｄｉｎｇｌｙ，ｍｏｒｅｏｖｅｒ，ａｓｉｇｎｉｆｉｃａｎｔｄｉｆｆｅｒｅｎｃｅｗａｓｆｏｕｎｄａｍｏｎｇｔｈｅｆｏｕｒｎｉｔｒｏｇｅｎｓｏｕｒｃｅｓ，ｓｈｏｗｉｎｇｎｉｔｒａｔｅ＞ｕｒｅａ＝ｇｌｙｃｉｎｅ＞ａｍｍｏｎｉｕｍ．Ｉｎｓｕｍｍａｒｙ，Ａ．ｔａｍａｒｅｎｓｅｃａｎｍａｉｎｔａｉｎｒｅｌａｔｉｖｅｌｙｈｉｇｈｇｒｏｗｔｈｒａｔｅａｎｄｍａｋｅａｌｇａｌｂｌｏｏｍｓｏｕｔｂｒｅａｋｃｏｎｔｉｎｕｏｕｓｌｙｒｅｇａｒｄｌｅｓｓｏｆｅｎｖｉｒｏｎｍｅｎ⁃ｔａｌｃｈａｎｇｅｓ，ｗｈｉｃｈｔｈｒｅａｔｅｎｓｔｈｅｅｃｏｌｏｇｉｃａｌｅｎｖｉｒｏｎｍｅｎｔｉｎｃｏａｓｔａｌａｒｅａｓ．Ｋｅｙｗｏｒｄｓ：Ａｌｅｘａｎｄｒｉｕｍｔａｍａｒｅｎｓｅ；ｇｒｏｗｔｈ；ｎｉｔｒｏｇｅｎｓｏｕｒｃｅ；ｔｏｘｉｃｉｔｙ；ｚｅｂｒａｆｉｓｈ（Ｄａｎｉｏｒｅｒｉｏ）．浙江省自然科学基金项目（ＬＹ１６Ｄ０６０００５）和温州市科技计划项目（Ｎ２０１６０００８）资助。收稿日期：２０１７⁃０３⁃２０　　接受日期：２０１７⁃０７⁃０８∗通讯作者Ｅ⁃ｍａｉｌ：[e-mail]生态学杂志ＣｈｉｎｅｓｅＪｏｕｒｎａｌｏｆＥｃｏｌｏｇｙ　２０１７，３６（１０）：２８８０－２８８５　　　　　　　　　ＤＯＩ：１０．１３２９２／ｊ．１０００－４８９０．２０１７１０．０１９　　氮元素是微藻合成蛋白质、核酸和叶绿素等有机物的基本物质，也是其生长繁殖的必需营养元素。然而，随着沿海地区人类活动的增加，大量的工业废水、生活污水和化学肥料排入近岸水体，导致近岸海洋生态系统中氮源含量及结构发生较大改变，即铵盐和有机氮所占总氮比例增加，从而对有害藻华种的生长、毒性造成影响（Ｇｌｉｂｅｒｔｅｔａｌ．，２００８）。如水体氮源种类及浓度的改变，可影响塔玛亚历山大藻（Ａｌｅｘａｎｄｒｉｕｍｔａｍａｒｅｎｓｅ）和米氏凯伦藻（Ｋａｒｅｎｉａｍｉｋｉｍｏｔｏｉ）的生长及对阳光紫外辐射的响应（李磊等，２０１６；Ｇｕａｎｅｔａｌ．，２０１７）。水体中有机氮（如尿素、氨基酸）等含量大幅增加还会影响有害藻华的生长和毒性。如尿素可诱发链状亚历山大藻（Ａ．ｃａｔｅｎｅｌｌａ）爆发藻华（Ｃｏｌｌｏｓｅｔａｌ．，２００７），并且显著增加了拟菱形藻（Ｐｓｅｕｄｏ⁃ｎｉｔｚｓｃｈｉａａｕｓｔｒａｌｉｓ）的毒素含量，其毒素产量是硝氮条件下的２倍，是铵氮条件下的３倍（Ｈｏｗａｒｄｅｔａｌ．，２００７）；丙氨酸也同样显著提升了铜绿微囊藻（Ｍｉｃｒｏｃｙｓｔｉｓａｅｒｕｇｉｎｏｓａ）的毒性（吴轩浩等，２０１５）。塔玛亚历山大藻在全世界广泛分布，其产生的麻痹性贝毒素（ｐａｒａｌｙｔｉｃｓｈｅｌｌｆｉｓｈｐｏｉｓｏｎｉｎｇ，ＰＳＰ）可对水产养殖和人类健康造成严重危害（Ａｎｄｅｒｓｏｎｅｔａｌ．，２０１２）。而以往的研究主要针对其生理、生态、毒理方面展开研究，如氮源和Ｎ／Ｐ的变化可影响塔玛亚历山大藻的生长和ＰＳＰ的含量及组成（Ｍｕｒａｔａｅｔａｌ．，２０１２）；ＣＯ２升高对塔玛亚历山大藻生长和元素组成影响不大，但细胞ＰＳＰ含量和毒性却会降低（ＶａｎｄｅＷａａｌｅｔａｌ．，２０１４）。研究表明，蓝藻粗提液及纯毒素对斑马鱼胚胎有明显的毒理作用（Ｌｉｅｔａｌ．，２００９），但有关塔玛亚历山大藻粗提液对斑马鱼胚胎发育的毒理致畸作用却知之甚少。一般认为，在硬骨鱼类的生命周期中，胚胎或幼鱼阶段是其对周围环境各种压力感知最为敏感的时期。模式生物斑马鱼由于产卵周期短，产卵量大，胚胎体积小且透明，发育迅速，易于饲养等优势，可以观察多种毒性指标，已被广泛运用于毒理学研究（Ｈｉｌｌｅｔａｌ．，２００５）。本文选用该藻作为研究对象，通过模式脊椎动物斑马鱼的胚胎发育评价该藻毒性对氮源（硝酸钠、氯化铵、尿素和甘氨酸）的响应机制，并检测了氮源对其生长和色素的影响，为进一步了解该藻响应环境变化的机制提供依据。１　材料与方法１􀆰１　实验藻种塔玛亚历山大藻由暨南大学提供。采用Ｆ／２培养基（Ｇｕｉｌｌａｒｄｅｔａｌ．，１９６２），在２００μｍｏｌｐｈｏｔｏｎｓ·ｍ－２·ｓ－１（１２Ｌ∶１２Ｄ）、２０℃的光照培养箱（ＧＴＸ⁃４３０Ｅ，江南仪器）中培养，取对数期藻细胞开展实验。氮源的调控：以不含氮源的人工海水（Ｂｅｒｇｅｓｅｔａｌ．，２００１）为培养基，选取４种氮源（２种无机氮：硝氮和铵氮；２种有机氮：尿素和甘氨酸）进行实验，Ｎ／Ｐ设定为塔玛亚历山大藻生长的最佳比例１６∶１（Ｎ、Ｐ的浓度分别为５７．６和３．６μｍｏｌ·Ｌ－１）（李磊等，２０１６）。微量元素、维生素按Ｆ／２的量添加，细胞接种密度为４×１０３ｃｅｌｌｓ·ｍＬ－１，分装至５００ｍＬ锥形瓶中进行一次性培养。每种氮源重复３次。１􀆰２　斑马鱼喂养及胚胎收集野生ＡＢ型成年斑马鱼，由国家斑马鱼资源中心（ＣｈｉｎａＺｅｂｒａｆｉｓｈＲｅｓｏｕｒｃｅＣｅｎｔｅｒ，ＣＺＲＣ）提供。依照ＺｅｂｒａｆｉｓｈＢｏｏｋ进行饲养（Ｗｅｓｔｅｒｆｉｌｅｄ，１９９５），水温维持在（２８．５±１）℃，ｐＨ为６．５～７．５，鱼房的光照周期为１４Ｌ∶１０Ｄ（早上８：００开始光照）。胚胎收集：配鱼时间在每天喂完晚餐３０ｍｉｎ后，雌、雄成年斑马鱼按１∶１或１∶２的比例放置在缸内，由隔板分开。次日清晨，灯亮后取下隔板，雌雄开始相互追逐交配。数分钟后（一般不超过３０ｍｉｎ）收集鱼卵。收集好的鱼卵用胚胎培养液（常嘉等，２０１３）冲洗３次，置于无菌２４孔板中，２小时后挑选成功受精的胚胎进行藻细胞毒性处理。１􀆰３　比生长速率（ｓｐｅｃｉｆｉｃｇｒｏｗｔｈｒａｔｅ）和色素的测定实验过程中，每天固定时间取藻液，采用浮游植物计数框在显微镜（ＢＸ５０Ｆ４，ＯｌｙｍｐｕｓＯｐｔｉｃａｌＣｏ．Ｌｔｄ．，Ｊａｐａｎ）下对藻细胞进行计数，根据公式（１）计算细胞比生长速率（单位：ｄ－１）：μ＝ｌｎ（Ｎｎ／Ｎｎ－１）／（ｔｎ－ｔｎ－１）（１）式中，Ｎｎ和Ｎｎ－１分别为ｔｎ和ｔｎ－１时的细胞数量。细胞生长对数末期，四组藻细胞每瓶各取１００ｍＬ的藻液用ＧＦ／Ｆ膜（Ｗｈａｔｍａｎ）过滤，加入５ｍＬ纯甲醇溶液置于４℃的黑暗条件下提取２４ｈ，２０００ｇ·ｍｉｎ－１离心１５ｍｉｎ，取上清用紫外可见光谱分析仪（Ａ５９０，翰艺仪器有限公司，上海）测定２８０～７００ｎｍ内的吸光值，依据Ｐｏｒｒａ（２００２）和Ｓｔｒｉｃｋｌａｎｄ（１９６８）的公式分别计算叶绿素ａ和类胡萝卜素的１８８２司冉冉等：氮源对塔玛亚历山大藻生长和毒性的影响含量。叶绿素ａ含量：Ｃｈｌ－ａ（μｇ·ｍＬ－１）＝１６．２９Ａ６６５．２－８．５４Ａ６５２（２）类胡萝卜素含量：Ｃａｒｏｔｅｎｏｉｄｓ（μｇ·ｍＬ－１）＝４Ａ４８０（３）式中，Ａ６６５．２、Ａ６５２及Ａ６６８分别为６６５、６５２及４８０ｎｍ处的吸光度。１􀆰４　藻细胞收集和胚胎毒性试验实验结束时，将藻液２０００×ｇ·ｍｉｎ－１离心１０ｍｉｎ后弃上清，收集到的藻细胞用超声波细胞粉碎机（ＪＹ９２⁃ＩＩＮ，宁波新芝生物科技股份有限公司）按功率２０％，３～５ｓ的间隔破碎５ｍｉｎ，后８０００×ｇ·ｍｉｎ－１离心１０ｍｉｎ取上清液（水溶藻内容物）。用胚胎培养液将收集到的藻细胞粗提液按照２×１０４、８×１０４ｃｅｌｌｓ·ｍＬ－１的浓度稀释后进行胚胎毒性试验。用无菌２４孔板将斑马鱼胚胎按照每孔１０枚进行分组，每个梯度３个平行，其中胚胎培养液作为空白对照，每孔加２ｍＬ的藻细胞粗提液，分别在受精１２、２４、３６和４８ｈ后用Ｍｏｔｉｃ倒置生物显微镜（ＡＥ２０００，麦克奥迪实业集团有限公司）观察胚胎发育（Ｋｉｍｍｅｌ