第六章微生物的生长繁殖与生存因子

微生物的生长繁殖微生物的生存因子其它不利环境因子对微生物的影响微生物与微生物之间的关系菌种的退化、复壮与保藏第六章微生物的生长繁殖与生存因子6.1微生物的生长繁殖一、微生物生长繁殖的概念生长（growth）：吸收营养物质同化大于异化细胞不断增长（重量、体积、大小）繁殖（reproduction）：个体数目增加生长是繁殖的基础，繁殖则是生长的结果。从生长到繁殖这个量变到质变的过程叫发育。一个微生物细胞合适的外界条件，吸收营养物质，进行代谢个体的生长原生质的总量(重量、体积、大小)就不断增加个体的繁殖如果各细胞组分是按恰当的比例增长时，则达到一定程度后就会发生繁殖，引起个体数目的增加群体内各个个体的进一步生长群体的生长多细胞微生物的生长只是细胞数目增加，不伴随个体数目增加；如果细胞数目增加，个体数目也增加，则称为多细胞微生物的繁殖6.1微生物的生长繁殖世代时间（G）细菌两次细胞分裂之间的时间，称为世代时间。指数生长：Nx＝N0·2n式中：Nx、N0为时间tx和t0时的细胞数，n为世代数世代时间会随着环境条件发生改变，环境工程中需要选取世代时间短的菌种，或缩短世代时间，以提高处理效率。个体生长个体繁殖群体生长群体生长＝个体生长＋个体繁殖6.1微生物的生长繁殖二、研究微生物生长的方法除了特定的目的以外，在微生物的研究和应用中，只有群体的生长才有意义。培养方法：分批培养（batchculture）连续培养（continuousculture）6.1微生物的生长繁殖（一）分批培养batchculture分批培养：将一定量的微生物接种在一个封闭的、盛有一定量液体培养基的容器内，保持一定的温度、pH和溶解氧量，微生物在其中生长繁殖。应用：生理特性研究、生物发酵和生物治污。将少量微生物一次接种于一定容积的培养基中生长培养，最后一次收获。静止期衰亡期细菌数目的对数值0时间t细菌的数量很大，都是10的n次方，取对数作图时方便总菌数活菌数停滞期对数期0+_6.1微生物的生长繁殖典型生长曲线（growthcurve）：定量描述液体培养基中微生物群体生长规律的实验曲线6.1微生物的生长繁殖1、停滞期（迟滞期或适应期）为什么会出现停滞期？细菌数停滞期目的对数值0时间t缺乏分解或催化有关底物的酶或辅酶缺乏充足的中间代谢物特征：生长速率为零，不立即进行细胞分裂、增殖，数量不变甚至减少细胞内RNA含量高，原生质呈嗜碱性代谢活跃，个体体积、重量增高细胞形态变大或增长对外界不良环境敏感6.1微生物的生长繁殖停滞期（迟滞期或适应期）影响停滞期长短的因素：菌种：遗传特性繁殖速度较快的菌种的延迟期一般较短；接种量：接种量大，停滞期短。接种群体菌龄：接种对数期的细菌，停滞期大大缩短。静止期或衰亡期基本耗尽各种辅酶或其它细胞成分，代谢产物积累中毒，而使停滞期延长。营养：从富集培养基转移到贫乏培养基中也出现停滞期。（尽量保持接种前后所处的培养介质和条件一致）。6.1微生物的生长繁殖停滞期（迟滞期或适应期）在实际工作中如接种菌种以启动新的水处理设施，投加新鲜污泥时，接种的细菌不习惯于新环境，会出现或长或短的迟缓期，迟缓期的出现会增加操作时间，降低工作效率。采用处于高效菌群对数期的菌种、增大接种量、尽量保持接种前后所处的培养介质和条件一致等方法来缩短或消除停滞期。6.1微生物的生长繁殖2、对数期细菌数目的对对数数期值0时间t特征：生长速率常数最大，代时最短酶系活跃，代谢旺盛对不良环境的抵抗力强群体中细胞的化学组分及形态、生理特性都比较一致指数生长：Nx＝N0·2n6.1微生物的生长繁殖x0lgNlgNnlg2x0lgNlgNnlg2x0ttGn对数期细菌代时G计算指数生长：Nx＝N0·2n21x00.301(tt)GNlgN6.1微生物的生长繁殖3、静止期特征：生生率＝死亡率活菌数达最高，且保持相对稳定开始积累贮存物质（PHB、异染粒、糖原、淀粉粒、脂肪粒等）细菌数目的静止期对数值0t时间原因：营养物尤其是生长限制因子的耗尽营养物比例失调有害代谢产物累积pH、氧化还原电位等物理化学条件变化6.1微生物的生长繁殖4、衰亡期特征：生生率＜死亡率活菌数减少细胞出现多形态、畸形或衰退型原因：内源呼吸，即自溶有毒代谢产物大量积累细菌数目的衰亡期对数值0t时间什么时期菌体代谢产物最多什么时期细菌细胞代谢活性最强什么时候细菌细胞总数最多什么时期世代时间短而稳定对数生长期静止期（最高生长量）静止期（最高生长量）对数生长期对数生长期小结6.1微生物的生长繁殖（二）连续培养continuousculture连续培养又称开放培养，具体地说，当微生物以分批培养的方式培养到指数期的后期时，一方面以一定速度连续流入新鲜培养基和通入无菌空气；另一方面，利用溢流的方式，以同样的流速不断流出培养物。容器内的培养物就可达到动态平衡，其中的微生物可长期保持在指数期的平衡生长状态和恒定的生长速率上，于是形成了连续生长。6.1微生物的生长繁殖恒浊连续培养光电池光源流速控制阀出水反馈控制恒浊——培养基浊度恒定（实质是细菌数量恒定）--不断调节流速使培养液浊度保持恒定。发酵生产较多（收获大量菌体和代谢产物），生物治污很少应用6.1微生物的生长繁殖恒化连续培养恒化——维持进水中的营养成分恒定--恒定流速，及时补充营养，营养物浓度基本恒定，从而保持恒定生长速率。又称恒组成连续培养。培养基成分中，必须将某种必需的营养物控制在较低的浓度，以作为限制性因子，而其它营养物过量。常用的有氨、氨基酸、葡萄糖、生长因子、无机盐等。应用：环境工程、生物工程、实验室研究（细菌生理特性研究、细菌的快速筛选研究等）流速控制阀出水不同点：分批培养：经历四个时期连续培养：理论上，对数生长期分批培养与连续培养特征的比较6.1微生物的生长繁殖恒化连续培养目前,污水连续生物处理法均类似于恒化连续培养。（流速不完全恒定）除了SBR法外，其余的污废水生物处理一般均采用恒化连续培养。6.1微生物的生长繁殖三、细菌生长曲线在污水微生物处理中的应用不同的生物反应器，乃至同一反应器的不同位置，细菌的生长状态可能不同！根据废水的水质情况，可利用不同生长阶段的微生物处理废水。细菌生长曲线在污水处理中的应用在废水处理中，不同系统状态可用不同生长阶段的微生物：用初期培养的活性污泥处理废水时，宜接种对数期微生物；在常规活性污泥法和生物膜法的处理运行中，宜接入稳定期微生物；用高负荷活性污泥法处理废水时，宜用对数期和稳定期微生物；对于有机物含量低、BOD5/COD0.3、可生化性差的废水，可用衰亡期微生物处理；对间歇排放的低浓度有机废水可采用含衰亡期微生物的间歇曝气法进行生物处理。连续生物处理中的细菌状态表细菌的生长阶段应用举例特点迟缓期无连续化稳定操作中没有这一阶段对数生长期高负荷活性污泥法(大部分区域)稳定期生物膜法常规活性污泥法(大部分区域)生长繁殖快，代谢活力强，能大量去除废水中有机物。（缺点是细菌表面的粘液层和荚膜尚未形成，运动很活跃，不易自行凝聚成菌胶团，沉淀性能差，致使出水水质有机物浓度相对较高）衰老期低浓度污水延时曝气法污泥的厌氧消化营养物浓度过低，难以满足其他阶段细菌的生长需要虽然比对数生长期的差，但仍有相当的代谢活力，细菌体内积累了大量贮存物，如异染粒、聚β—羟基丁酸等，体表的粘液层和荚膜强化了细菌的生物吸附能力，自我絮凝、聚合能力强，在二沉池中泥水分离效果好，出水水质好。1:0.4~0.8BOD.d-细菌与降解BOD重量比1:0.4以下进水对数期衰老期平推流式活性污泥法稳定期占优势6.1微生物的生长繁殖四、微生物生长量的测定方法测定不同种类、不同生长状态微生物的生长情况，需要选用不同的指标。通常对单细胞微生物来说，既可测定细胞数目，又可测定生长量；而对多细胞(尤其是丝状真菌)，则常以菌丝生长的长度等作为生长指标。测定微生物生长的方法多种多样，在实际工作中，可根据研究对象或要解决的问题加以选择。测定微生物总数测定活细菌数计算生长量6.1微生物的生长繁殖（一）测定微生物总数计数器直接计数染色涂片计数比例计数比浊计数法借助显微镜直接观察测定——优点：快速——缺点：不能区分细菌死活6.1微生物的生长繁殖测定活细菌数稀释培养计数生长较慢的细菌过滤计数微孔滤膜过滤，将膜置于已倒好的平板上培养得到生长的菌落，计数。菌落计数10倍稀释法稀释成系列菌液，然后各取1mL置于无菌平皿中，培养，计数。（二）间接计数法(活菌计数法)6.2微生物的生存因子微生物和环境有着密切的关系，环境因子影响微生物的生长繁殖，微生物的生长又反过来影响环境。环境适宜时，微生物能旺盛生长；环境改变，微生物的代谢也发生变化，轻则使生长受到抑制，重则引起死亡。目的：创造适宜环境，促进有益微生物生长；应用不利条件，控制微生物的不利影响或无用微生物的生长生存因子：生物生存所不可缺少的环境条件6.2微生物的生存因子一、温度由于微生物的生命活动都是由一系列生物化学反应组成的，而这些反应受温度影响又极其明显，故温度是影响微生物生长繁殖的最重要因素之一。生长速率0温度℃最低温度最适温度最高温度最适温度是生长繁殖最快的温度。为什么会存在适宜温度？酶的活性根据细菌适宜温度的不同，可将细菌分为四大类，嗜冷菌、嗜中温菌、嗜热菌及嗜超热菌。6.2微生物的生存因子低温、中温和高温细菌的生长温度范围细菌最低温度℃最适温度℃最高温度℃嗜冷菌-5～05～1020～30嗜中温菌5～1025～4045～50嗜热菌3050～6070～80嗜超热菌55以上70～105110～1136.2微生物的生存因子嗜热菌和超嗜热菌包括芽孢杆菌和嗜热古菌。55～75℃＞75℃专性嗜热菌、兼性嗜热菌超嗜热菌嗜冷菌可在0℃左右低温生存。各种微生物的最适温度不同。废水中的细菌一般都是嗜中温菌，最适宜温度在30℃左右。嗜冷菌和嗜热菌占少数。6.2微生物的生存因子低温：细胞结冻～最适温度下限。对中温、高温菌不利，休眠？酶活性降低，导致代谢、遗传普遍停滞。细胞膜流动性变差。一旦获得适宜温度，即可恢复活性。嗜中温菌（耐冷喜温）一般在5℃以下处于休眠状态，因此实验室常用冰箱的4℃冷藏温度保存细菌或甘油、石蜡冷冻保存。低温的影响6.2微生物的生存因子嗜冷微生物的最适宜温度为5～15℃。嗜冷微生物能在低温生长的原因：具备低温活性酶；细胞质膜含大量的不饱和脂肪酸，低温下保持半流动性；主动输送营养物质的功能运转良好。嗜冷菌的环保用途低温的影响6.2微生物的生存因子二、pH微生物的生命活动、物质代谢与pH有密切关系。不同微生物对pH的要求有不同。微生物对pH的要求也存在最高、最低和最适三个点。常见的四大类微生物中，对pH的最适（范围）要求分别是，细菌：6.5-7.5（4-10）；放线菌：7-8（5-10）；霉菌：3-6（1.5-10）；酵母菌：5-6（1.5-10）。研究表明细胞内部由于细胞膜的屏蔽作用、磷酸盐缓冲及细菌能动的调节，pH一般都保持中性，环境的pH难以影响细胞内的pH变化。6.2微生物的生存因子外界pH如何对微生物产生影响影响细胞膜蛋白及胞外水解酶的活性从而影响营养物的正常吸收与转运影响营养物的解离与吸收中性或碱性pH阴离子状态酸性pH下的分子状态OOCH3═C═O-CH3═C═OH同性相斥，难以吸收正常吸收细菌表面带有电荷，如“—”6.2微生物的生存因子应用各种工业废水通常设前调节池，维持曝气池pH7左右。事实上，净化污(废)水的微生物适应pH变化的能力比较强，pH在6.5～8.5均可不加调节。pH较低的废水可用霉菌、酵母菌处理，但要控制活性污泥丝状膨胀。有机固体堆肥的pH为5～8。废水和厌氧污泥消化中，pH最好控制在6.8～7.2之间。6.2微生物的生存因子微生物培养中的pH控制微生物在其生命活动过程中也会能动地改变外界环境的pH，这就是通常遇到的培养基的原始pH值会在培养微生物的过程