对虾养殖水体氨氧化菌的多样性分析与硝化作用的特征蔡小龙

522011,Vol.32,No.增刊食品科学氨氮对鱼虾等具有毒害作用，氨氮污染严重危害了水产养殖业的发展，并引起了环境生态问题与食品安全问题。对虾养殖水体环境是一个活跃的生物硝化系统，作为这个系统中的主要成员，氨氧化微生物扮演着一个极其重要的角色，它能将有害的氨氮氧化为亚硝氮并最蔡小龙，林炜铁*(华南理工大学生物科学与工程学院，广东广州510006)摘　要：为了研究珠三角地区不同空间分布的对虾养殖水体中氨氧化菌多样性的异同与探究养殖水体中氨氧化菌的硝化作用特征，应用PCR-DGGE技术，结合非加权算术平均法(UPGMA)聚类分析和多维尺度分析(MDS)的方法，对珠三角地区7个对虾养殖场的水样中氨氧化菌的多样性进行对比分析，继而构建了模拟养殖生态系统，评估了系统中微生物的硝化能力和硝化作用特征。结果表明：在养殖水体中，氨氧化古菌的类别明显少于氨氧化细菌，各样品间相似性较低，为41%到80%，没有高相似性的聚类；模拟系统中存在连续完整的亚硝化与硝化作用。关键词：对虾养殖；氨氧化菌；变性梯度凝胶电泳；聚类分析；模拟系统；硝化作用Diversityofammonia-oxidizingmicroorganisminwatersofshrimpcultureandnitrificationcharacteristicsCAIXiao-long，LINWei-tie*(SchoolofBiologicalScienceandEngineering,SouthChinaUniversityofTechnology,Guangzhou510006,China)Abstract：Thispaperaimstostudythediversityofammonia-oxidizingmicroorganisminshrimpculturewatersfromdifferentareasofthePearlRiverDelta,andrevealthenitrificationcharacteristicsinaquaculturewaters.PCR-DGGE,unweightedpair-groupmethodwitharithmeticmeans(UPGMA)clusteranalysisandmultidimensionalscaling(MDS),wereappliedtocompareandanalyzesevenaquaculturewatersamplesfromdifferentareasofthePearlRiverDelta.Afterwards,anartificialaquacultureecosystemwasusedtoassesthenitrificationabilitiesandcharacteristicsofmicroorganisms.Theresultsshowedthatthediversityofammonia-oxidizingarchaeawaslessthanthatofammonia-oxidizingbacteria,andthesimilarityamongdifferentsampleshadainsignificantdifference,from41%to80%.Nitrosationandnitrificationcoexistedinthemodelecosystem.Keywords：Shrimpculture；Ammonia-oxidizingmicroorganism；Denaturinggradientgelelectrophoresis(DGGE)；Clusteranalysis；Modelaquacultureecosystem；Nitrification中图分类号：Q938.1；S917.1文献标识码：A文章编号：1002-6630(2011)增刊1-0052-06终被硝化细菌氧化为硝酸盐，氨氧化过程是硝化作用的限速步骤，在氮素的生物地球化学循环中起着重要的作用[1]。硝化作用包括氨氧化作用和亚硝酸盐氧化作用，氨氧化作用即亚硝化作用，由氨单加氧酶(ammoniamonooxygenase，AMO)催化完成。传统理论认为，收稿日期：基金项目：国家自然科学基金（21076090）作者简介：蔡小龙（1987-），男，硕士研究生，研究方向为环境微生物学。Tel:[phone]；E-mail:[e-mail].*通信作者：林炜铁（1964-），男，副教授，研究方向为环境微生物学；E-mail:[e-mail].53食品科学2011,Vol.32,No.增刊氨氧化作用仅限于氨氧化细菌(ammonia-oxidizingbacteria,AOB)，古菌未参与其中。直到最近几年，Venter[2]和Treusch[3]等人研究发现，古菌中也有AMO编码基因amoA序列的存在；Knneke等[4]在2005年成功分离到一株带有amoA基因的泉古菌Nitrosopumilusmaritimus，证实了氨氧化古菌(Ammonia-oxidizingarchaea,AOA)amoA基因与氨氧化作用之间的联系。由此掀起了氨氧化古菌的研究热潮。由于传统培养方法的局限性，目前对于环境微生物生态的研究手段仍以分子生物学技术为主，如宏基因组技术[5]、变性梯度凝胶电泳(DenaturingGradientGelElectrophoresis,DGGE)[6]和末端限制性酶切片段长度多态性分析(terminalrestrictionfragmentlengthpolymorphism,T-RFLP)[7]等。DGGE能够真实地再现微生物的菌群结构，电泳图谱上的每个条带代表一个特定序列的DNA片段，在一个凝胶中不同泳道之间停留在相同位置的条带，可以被认为含有相同的DNA序列[6]。因此，DGGE技术被广泛用于微生物多样性的分析比较中。采用了PCR-DGGE和聚类分析的方法，对珠三角4个地区7个对虾养殖场水样中的氨氧化菌群落的多样性进行比较分析，继而以最具代表性的一个水样为模板，在实验室条件下构建了模拟养殖水体系统，考察和比较了氨氮、亚硝酸氮和硝酸氮浓度随时间的变化规律和反应速率大小，初步探究了系统中硝化微生物的硝化作用能力与特征。旨在揭示珠三角各地氨氧化菌的分布规律与对虾养殖水体中硝化作用的特征，以期为对虾养殖系统中氮素的有效管理提供参考依据，对安全健康养殖体系的形成起到一定的指导作用，继而避免水产品食品安全问题的发生。１　材料与方法1.1　材料与试剂样品分别采集于珠三角地区水产养殖业较集中的江门市、珠海市、中山市和台山市的7个养殖场，采样时间为2010年11月。PCR试剂北京百泰克公司；琼脂糖西班牙Biowest公司；丙烯酰胺、去离子甲酰胺美国Amersco公司；甲叉双丙烯酰胺美国Sigma公司；氯化铵（分析纯）天津市大茂化学试剂厂；引物广州英骏生物技术有限公司。1.2　仪器与设备T1ThermocyclerPCR仪德国Biometra公司；DYY-6C型核酸电泳系统北京六一仪器厂；凝胶成像系统、DGGE电泳系统美国BIO-RAD公司。1.3　方法1.3.1样品采集与预处理采用正方形5点取样法，用经无菌的有机玻璃采水器在水深约0至1米处垂直取样，每个点取样量约为500mL，均匀混合后再从其中取出500mL，立即置于4℃保存，并尽快运送回实验室检测、提取基因组DNA并于-20℃保存。各水样的采集信息如表1所示：表1　不同空间取样养殖水的基本信息Table1　Informationofsamplesfromdifferentareas样品编号采集地点面积(亩)总N(mg/L)养殖时期1江门市潮连镇(E113°8’,N22°36’)107.85后期2台山市广海镇(E112°49’,N21°58’)85.48后期3中山市港口镇(E113°25’,N22°36’)176.06中期4珠海市红旗镇(E113°20’,N22°9’)116.17后期5中山市板芙镇(E113°17’,N22°24’)107.17中期6江门市大鳌镇(E113°10’,N22°27’)127.85后期7台山市海晏镇(E112°37’,N21°48’)125.46后期注：a：指开挖池塘养殖的年龄1.3.2　总DNA提取每个样品取200mL，8000×g离心5min收集菌体，采用溶菌酶-蛋白酶K-SDS-CTAB法[8]提取基因组总DNA，以1%琼脂糖凝胶电泳检验其DNA浓度。1.3.3　PCR扩增以提取的总DNA为模板，分别利用Arch-amoAF/Arch-amoAR-GC和amoA-1F-GC/amoA-2R两个引物对AOA与AOB功能基因amoAα亚基的片段进行特异性扩增。各引物信息如表2所示。表2　本实验所使用的PCR引物Table1　Informationofsamplesfromdifferentareas引物名称引物序列文献Arch-amoAF5'-SaTAATGGTCTGGCTTAGACG-3'[9]Arch-amoAR-GC5'-bGCGGCCATCCATCTGTATGT-3'[9]amoA-1F-GC5'-bGGGGTTTCTACTGGTGGT-3'[10]amoA-2R5'-CCCCTCKcGSAAAGCCTTCTTC-3'[10]注：a:S：(G/C)。b:加上GC夹(5’-CGCCCGCCGCGCCCCGC-GCCCGGCCCGCCGCCCCCGCCC-3’)[11]；c:K：(G/T)PCR反应体系为25μL，含有10×PCRBuffer2.5μL，模板DNA2.0μL，dNTPs(2.5mmol/L)2.0μL，正、反引物各0.5μL(20mol/L)，TaqDNA聚合酶(5U/μL)0.5μL，其余用超纯无菌水补齐。利用引物Arch-amoAF/Arch-amoAR-GC进行PCR的反应程序：94℃预变性4min，94℃，1min，55℃1min，72℃，1min，30个循环，72℃，10min。利用引物amoA-1F-GC/amoA-2R进行PCR的反应程序：94℃预变性4min，94℃，1min，60℃1542011,Vol.32,No.增刊食品科学min，72℃，1min，35个循环，72℃，6min。PCR产物用1.5%浓度的琼脂糖凝胶进行电泳检测。1.3.4　变性梯度凝胶电泳(DGGE)与图谱分析对PCR产物进行DGGE分析，丙烯酰胺凝胶质量分数为10%，检测AOAPCR产物变性剂浓度为30%-50%；检测AOBPCR产物变性剂浓度为40%-60%(7M尿素和40%甲酰胺浓度定义为100%变性浓度)。在80V、60℃条件下电泳12h。电泳结束后按银染色法染色，再用扫描仪拍摄成像[11]。使用凝胶分析软件QuantityOne和SPSS软件对DGGE图谱进行编辑分析，用非加权算术平均法(UPGMA)和多维尺度(MDS)法对不同空间样品进行聚类分析和维度分析[6]，以阐述不同样品间的关系。1.3.5　模拟养殖生态系统的构建模拟生态系统也称为微宇宙，它利用实验仪器控制环境条件以模拟生态环境，主要用于研究化学物质的生态学过程，具有良好的真实性，因此在化学物质的危险性评价中得到广泛的应用。为研究养殖塘中硝化作用的特征，评估硝化菌对氨氮和亚硝氮的降解能力，建立了一个模拟生态系统，即为一个容积约为20L的水族箱，在其底部均匀铺垫约5cm厚的养殖塘底泥，再缓慢灌注15L养殖塘水，置于向阳的阳台。每两天补充一次因蒸发和取样而减少的水分。养殖塘底泥和养殖塘水均采自中山市港口镇(E113°25',N22°36')，采样前两周内未使用任何微生物制剂产品。待系统稳定三天后开始投入氯化铵，进行硝化实验。氨氧化菌的最佳生长温度为22～27℃，最佳pH值为7.8～8.3[12,13]，因此将模拟系统的温度控制在25℃±2℃，pH8±0.5，溶氧4±1mg/L。1.3.6