废水反硝化生物反应器中喹啉降解细菌的分离与特性洪璇

应用与环境生物学报2008，14(6):803~808ChinJApplEnvironBiol=ISSN1006-687X2008-12-25DOI:10.3724/SP.J.1145.2008.00803喹啉是煤炭化工产生的废水中主要的难降解污染物之一.喹啉具有较强的毒性，对人类具有潜在的致癌作用.工业废水中喹啉的含量虽较低，但由于排放标准中只注重COD的去除情况，对于喹啉等含量相对较小的氮杂环类难分解污染物的去除效率关注不够，使喹啉成为土壤、地下水及其它水体中常见的污染物之一.因此，寻找喹啉分解细菌资源，研究喹啉的降解机制，为喹啉降解效率的提高提供理论依据，对减少其排放、改善环境具有积极意义.有关喹啉的降解在上世纪八、九十年代已有大量的研究，期间主要是关于单个的微生物分离菌株对喹啉的降解研究，包括环境化学与酶学研究，通过环境中微生物的作用，跟踪研究喹啉的降解及其过程，揭示降解代谢途径与动力学[1~3]，也已报道了多种微生物能降解喹啉，如Rhodococcussp.、Comamonastestosteroni、Psuedomonasputida、Desulfobacteriumindolicum、Burkholderiapicekttii、Sphingopyxissp.和白腐菌等[3~9].目前已知的喹啉降解途径有4种[10]，大多是通过分离好氧菌研究而获得的.喹啉及一些衍生物也能在缺氧的条件下得到降解，如Johansen等(1997)和Li等人(2001)的研究[4,11].一些研究者也通过分离的反硝化菌研究了喹啉等难降解有机物[4]，发现在反硝化条件下杂环类化废水反硝化生物反应器中喹啉降解细菌的分离与特性*洪璇张晓君**孟智奇林振华刘彬彬朱晨光赵立平(上海交通大学生命科学技术学院，教育部微生物代谢重点实验室上海200240)IsolationandCharacteristicsofQuinolineDegradingBacteriafromWastewaterDenitrifyingBioreactor*HONGXuan,ZHANGXiaojun**,MENGZhiqi,LINZhenhua,LIUBinbin,ZHUChenguang&ZHAOLiping(KeyLaboratoryofMicrobialMetabolism,MinistryofEducation,SchoolofLifeScienceandBiotechnology,ShanghaiJiaoTongUniversity,Shanghai200240,China)AbstractQuinoline,anitrogenousheterocycliccompound(NHC),isacommonpollutantinmanyfossilindustrieswastewaters,suchascokingplantwastewater.Duetothelimitationofknowledgeforthediversityofquinolinedegradingbacteria,theisolationofdiversedegradingbacteriafromquinolinecontaminatedenvironmentisimportantworknotonlyforunderstandingtheprocessofquinolinedegradation,butalsoforoptimizingthewastewatertreatment.Inthisstudy,56strainsofquinolinedegradingbacteriawereisolatedfromquinolineacclimatedbioreactorandcokingwastewatertreatmentbioreactorunderdifferentcultureconditions.Thesestrainsweregroupedinto12OTUsbyADRDAandtherepresentativesequencesoftheseOTUswereaffiliatedtoOchrobactrum,Bacillus,PseudomonasandRhodococcus.Someofthesestrainswereusedformeasuringtheirquinolinedegradingcapabilities.Mostoftheassayedstrainsshowedhighdegradingefficiency,exceptthatafewstrainscouldnotdegradequinolineindependently.Asweknow,itisthefirstreportthatthebacteriaofOchrobactrumcoulddegradequinolinesofar.Fig2,Tab3,Ref31Keywordsquinoline;denitrification;degradingefficiency;isolate;16SrDNA;wastewaterCLCX172收稿日期:2007-10-17接受日期:2008-02-29∗国家自然科学基金项目(No.20677041)，“863”计划重点项目(No.2007AA021301)，上海市国际合作项目(No.05SR07107)和上海市重点学科建设项目(No.B203)资助SupportedbytheNationalNaturalScienceFoundationofChina(No.20677041),theNational“863”High-techR&DProgram(No.2007AA02Z203),theShanghaiInternationalCollaborationProject(No.05SR07107),andtheShanghaiLeadingAcademicDisciplineProject(No.B203)**通讯作者Correspondingauthor(E-mail:[e-mail])摘要杂环化合物喹啉是焦化等工业废水中的一种难降解化合物.有关喹啉微生物降解的研究还很有限，分离筛选多样的喹啉降解细菌，对认识喹啉的降解机制和强化废水中喹啉的降解具有重要意义.本研究通过富集和多种分离条件的培养，从焦化废水活性污泥及喹啉驯化的生物膜样品中分离获得56株与喹啉降解相关的菌株，以16SrDNA双酶切方法进行ARDRA分型，将这些菌株分为12个OTU.选取部分代表菌株进行16SrDNA测序分析，表明分离所获得的菌株主要是Ochrobactrum、Bacillus、Pseudomonas和Rhodococcus属的微生物.通过对部分菌株测定其喹啉降解能力，发现大部分菌株都能以喹啉为唯一碳源进行生长并高效降解喹啉，极少数菌株不能单独降解喹啉.降解喹啉的Ochrobactrum属菌株还未见报道.图2表3参31关键词喹啉；反硝化；降解率；分离菌；16SrDNA；废水CLCX17280414卷应用与环境生物学报ChinJApplEnvironBiol合物具有更高的降解效率.我们曾建立了一个实验室反硝化喹啉降解生物反应器，经过约6wk的驯化达到稳定后，喹啉去除率达到90%以上.对该反应器微生物群落的研究发现，变形菌纲β亚纲的微生物成为主要的类群，其中Thauera和Azoacus属的微生物具有明显的优势[12].这表明该反应器中的主要降解菌类型与目前已知的喹啉降解菌有区别.还有更多样的喹啉降解微生物资源有待人们去发掘.本文从实验室驯化的反硝化喹啉降解生物反应器和工业化的焦化废水处理系统的活性污泥样品中，通过不同的途径分离了一批细菌，对这些细菌进行了分型与16SrDNA的鉴定，并对其中部分分离物分解喹啉的能力进行了初步测定，从而为深入研究焦化废水处理反应器中喹啉的降解机制奠定基础.1材料与方法1.1生物膜样品样品菌株分别分离自喹啉驯化的生物反应器生物膜样品和某焦化厂污水缺氧处理池的生物膜样品.喹啉驯化的反硝化生物反应器(DR)的体积均为18L，鞣性材料作为填料.实验采用人工配水，以喹啉和葡萄糖为碳源，浓度分别为40mg/L和180mg/L，(NH4)2SO4和NaNO3为氮源，KH2PO4为磷源，并保持C/N/P＝150/5/1.运行条件为：HRT12h、温度30℃、进水pH7.0、DO0.1mg/L.经过6wk的驯化后，反应器达到稳定运行状态，取生物膜样品进行分析.污泥样品取自某焦化厂A2/O工艺的废水处理系统的A2池.1.2样品的预处理、培养与细菌分离取大约5mL采集的生物膜样品和污泥样品放入50mL离心管中，加5倍体积的TENP缓冲液(50mmol/LTris，20mmol/LEDTA，100mmol/LNaCl，0.01g/mLPVP，pH10)和少量灭菌的玻璃珠充分旋涡振荡约5min，10000×g，4℃离心5min，收集沉淀(必要时重复洗涤2~3次).加25mLPBS缓冲液(0.145mol/LNaCl，0.003mol/LKCl，0.010mol/LNa2HPO4，0.002mol/LKH2PO4，pH7.4)，旋涡振荡，然后10000×g，4℃离心5min，收集沉淀(重复2次).加15~20mLPBS悬浮，分装到10mL离心管(每管加4mL悬浮液和1mL灭菌甘油)，存放在－70℃冰箱.将100μL经过预处理的生物膜或活性污泥样品接入含10mL液体喹啉培养基的试管内，置于28℃培养箱培养3~5d后，取1mL培养液转接至9mL喹啉液体培养基中再进行培养，反复转接多次进行富集培养.将每轮富集培养的菌液稀释后涂布到固体反硝化培养基或喹啉降解分离培养基上.置于28℃培养箱培养2~5d后，挑取培养基上具有代表性的菌落，进一步纯化后，编号并保存菌株.1.3分离和培养用培养基[13](1)喹啉降解菌分离用培养基(g/L)：Na2HPO41.6，KH2PO41.0，NH4Cl0.5，K2SO40.06，CaCl2.2H2O0.025，MgCl2.6H2O0.1，NaHCO30.42，EDTA-Na20.015，FeSO4.7H2O0.0015，D-Biotin0.010，KNO30.505;喹啉0.5mmol/L.(2)反硝化培养基(g/L)：Na2HPO41.6，KH2PO41.0，NH4Cl0.5，K2SO40.06，CaCl2·2H2O0.025，MgCl2·6H2O0.1，NaHCO30.42，EDTA-Na20.015，FeSO4.7H2O0.0015，D-Biotin0.010，KNO30.505，乙酸钠2.041，酒石酸钠钾4.233.上述培养基的固体培养基均加入15g/L琼脂，培养基均以121℃、20min的条件灭菌.1.4DNA提取LB液体培养基培养各菌株过夜(37℃)，取1.5mL10000r/min离心2min；然后取沉淀，加入567µL的TE缓冲液后重新悬浮菌体，加入30µL10%SDS和3µL蛋白酶K(20mg/mL)，混匀，37℃温育1h；之后加入100µL5mol/LNaCl，充分混匀，再加入80µL1.5mol/LCTAB/NaCl溶液，混匀后65℃温育10min；加入等体积的酚/氯仿/异戊醇，混匀，13000r/min离心5min.将上清转入新管,加入等体积的氯仿/异戊醇，混匀后13000r/min离心5min，将上清转入新管，再加入0.6体积异丙醇，轻轻混合直到DNA沉淀下来，13000r/min离心并去除上清液后，加入1mL的70%乙醇洗涤，13000r/min离心5min，弃上清，干燥后重溶于25µL的TE缓冲液，得到的DNA样品在－4℃冰箱保存.1.5菌株16SrDNA的PCR扩增16SrRNA基因的全长扩增采用细菌通用引物27F(59-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-39)和1492R(59-GGTTACC