复合碳源填料反硝化脱氮及微生物群落特性

中国环境科学2015,35(10)：3003~3009ChinaEnvironmentalScience复合碳源填料反硝化脱氮及微生物群落特性赵文莉1,2,郝瑞霞1*,王润众1,杜鹏1(1.北京工业大学北京市水质科学与水环境恢复工程重点实验室,北京100124；2.北京桑德环境工程有限公司,北京100081)摘要：为探讨低碳氮比污水厂尾水的深度脱氮技术,以碱处理玉米芯、零价铁和活性炭组成的复合碳源作为填料,考察反硝化生物脱氮滤柱的运行效果,并借助Miseq高通量测序技术对滤柱生物膜的微生物群落组成和结构进行解析.结果表明,复合碳源填料进行反硝化脱氮时,能有效的被微生物利用并获得较高的TN去除率.在温度为28℃左右,反硝化滤柱进水NO3--N浓度为20~30mg/L、HRT=7.7h时,TN去除率可达到95%以上,出水TOC在15mg/L左右;微生物在属水平进行聚类分析结果表明,生物膜中与反硝化作用有关的菌属和与纤维素降解有关的菌属分别占已知菌属的40.35%和29.04%.因此,污泥中反硝化作用菌属和纤维素降解有关的菌属的大量存在,为复合碳源填料高效反硝化作用提供了可能.关键词：复合碳源填料；反硝化脱氮；Miseq高通量测序；微生物群落特性中图分类号：X703.1文献标识码：A文章编号：1000-6923(2015)10-3003-07Denitrificationofcompositecarbonfillerandcharacterofmicrobialcommunity.ZHAOWen-li1,2,HAORui-xia1*,WANGRun-zhong1,DUPeng1(1.CollegeofArchitectureandCivilEngineering,BeijingUniversityofTechnology,Beijing100124,China；2.BeijingSoundEnvironmentGroupLtd,Beijing100081,China).ChinaEnvironmentalScience,2015,35(10)：3003~3009Abstract：TostudyadvanceddenitrogenationoflowC/Nratioeffluentfrommunicipalwastewatertreatmentplant,thecompositecarbonfillercomposedofcorncobpretreatedbyalkali,zero-valentironandactivatedcarbonwasmade.TheperformanceofcompositecarbonfillerdenitrificationsystemwasinvestigatedandMiseqhigh-throughputwasalsoappliedtostudythemicrobialcommunitystructures.Compositemediaindenitrificationcouldbeeffectivelyusedandachieveahighertotalnitrogen(TN)removalrate.TheTNremovalefficiencyofthedenitrificationreactorcouldbeabove95%andtheconcentrationofTOCintheeffluentwasabout15mg/Lwhenthetemperaturewasabout28℃,theHydraulicRetentionTime(HRT)was7.7handtheinflowNO3--Nwasabout20~30mg/L.Theanalysisrevealedthatatthegenuslevelthegenerarelatedtodenitrifyinganddegradationofcellulose,wasaccountedfor40.35%and29.04%whichwererelatedtoknownbacteria,respectively.So,themassesofdenitrifyingbacteriaandcellulolyticbacteriuminthesludgemadeitfeasibletodenitrifyofcompositecarbonfillerefficiently.Keywords：compositecarbonfiller；denitrification；Miseqhigh-throughput；characterofmicrobialcommunity生物反硝化分为异养型和自养型2种,其中自养型通常以H2或硫单质为电子供体,而异养反硝化需要添加有机碳源作为反硝化微生物生长繁殖的营养源.对于低C/N再生水反硝化生物脱氮常需外加碳源,常规的做法是投加甲醇、乙醇等溶解性碳源[1-2],这类碳源易溶于水,反应快,但投加量不易控制,容易造成二次污染.目前已有不少研究者采用固体碳源[3-8],如玉米芯、棉花、稻杆和竹丝等,这类碳源能避免连续投加,节省成本,简化操作,但却存在反硝化速率低、出水色度高等问题.赵文莉等[9]在预处理方法对玉米芯作为反硝化固体碳源影响研究中发现,碱处理玉米芯的碳源释放量和处理程度最为适宜,有利于反硝化微生物的降解和利用,在运行的41d中,脱氮效率始终维持在90%以上;Rocca等[10]以Fe0和棉花联合去除硝酸盐时发现,Fe0和棉花同时存在时出水中硝酸盐浓度最低,氨氮浓收稿日期：2015-03-26基金项目：国家自然科学基金项目(51178005)*责任作者,教授,[e-mail]3004中国环境科学35卷度低于国家标准,但反硝化后期反应器内出现填料层堵塞现象.李斌等[3]在玉米芯与海绵铁复合填料反硝化脱氮特性研究中,也发现复合填料反硝化效果优于单纯玉米芯填料,但也存在填料层堵塞、出水色度高等问题.可见将生物、化学方法联合,发挥各自的优势,对硝酸盐去除有积极的作用,但针对生物、化学联合法中填料层堵塞、出水色度高等问题开发新型复合填料的研究却未见报道.近年来,越来越多的分子生物学手段被用来研究污水处理过程中微生物群落结构特性,如变性梯度凝胶电泳、克隆文库和高通量测序等.Miseq高通量测序技术以Illumina的边合成边测序技术为基础,通过可逆终止试剂方法对数百万个片段同时进行大规模平行测序,具有分析结果准确、高速等特点,被广泛应用于污水处理过程中微生物群落结构和多样性研究[11-14].本研究将活性炭与铁丝、碱处理玉米芯同时填充到聚乙烯球中,作为反硝化滤池的复合碳源填料,以期解决生物、化学反硝化联合法在出水色度高、填料易堵塞等方面的问题,并结合反硝化滤池运行情况及出水水质,利用Miseq高通量测序技术对反硝化滤池中微生物结构进行分析,考察复合碳源填料脱氮及微生物特性.1材料与方法1.1试验材料将蒸煮后玉米芯洗净,切成体积约为1cm3的块状,放在80℃的干燥箱中烘干后,放入1.5%NaOH中浸泡18h,洗净,中和,干燥备用.零价铁为市售铁丝球,活性炭为直径在2~4mm的果壳活性炭,直径80mm的聚乙烯悬浮球.1.2试验装置及用水试验DN柱采用有机玻璃制成,内径为200mm,高为1500mm,底部设有穿孔板,起到承托滤料及均匀配水的作用.柱中填充57个直径为80mm的聚乙烯悬浮球,每个悬浮球中填充36g复合碳源填料,复合碳源填料中(碱预处理玉米芯):(活性炭+铁丝)=5:1.动态试验用水模拟污水厂二级出水最不利水质,由自来水中加入KNO3和KH2PO4,保持C:N:P=0:5:1,并加入微量元素溶液配制而成.试验进水方式为上向流.复合碳源填料反硝化脱氮生物滤柱(DN)如图1所示.12534图1复合碳源填料反硝化脱氮生物滤柱示意Fig.1Schematiclayoutofdenitrificationsystemofcompositecarbonfiller1.储水池;2.进水泵;3.承托层;4.复合填料;5.出水口1.3试验方法及样品采集DN柱采用接种挂膜法启动,接种污泥来自北京某污水厂回流污泥,接种前用含一定浓度硝酸钾的生活污水富集培养反硝化细菌.DN柱运行159d,期间环境温度为28℃左右,pH=7.5~8.0,监测运行期间DN柱进出水的TOC、TN、NO3--N、NO2--N、NH4+-N及pH值,并在DN柱运行稳定至150d时,采集玉米芯表面的生物膜样品,在-20℃低温冰箱中保存.考察复合碳源填料反硝化生物脱氮工艺的特性及微生物多样性.1.4分析指标与方法1.4.1常规指标分析表1列出了常规分析的方法及其所需仪器.1.4.2微生物多样性的测定DNA的提取与PCR的扩增:采用试剂盒法,按照Ezup柱式基因组DNA抽取试剂盒说明书提供的操作步骤提取.提取的DNA用1%琼脂糖凝胶电泳进行检测.10期赵文莉等：复合碳源填料反硝化脱氮及微生物群落特性3005PCR的扩增区域为16SrRNA的V3+V4区,其中16SrRNA的引物名称及引物序列分别为:338F:ACTCCTACGGGAGGCAGCA(测序端);806R:GGACTACHVGGGTWTCTAAT.PCR采用TransGenAP221-02:TransStartFastpfuDNAPolymerase,20µL反应体系:5×FastPfuBuffer,4µL;2.5mMdNTPs,2µL;ForwardPrimer(5µmol/L),0.8µL;ReversePrimer(5µmol/L),0.8µL;FastPfuPolymerase0.4µL;TemplateDNA,10ng;补充ddH2O20µL用ABIGeneAmp®9700型扩增仪扩增,反应程序:先95℃预变性3min;然后进行27个循环(95℃变性30s,55℃退火30s,72℃延伸45s),最后72℃延伸10min.用AxyPrepDNA凝胶回收试剂盒(AXYGEN公司)切胶回收PCR产物,经Tris-HCl洗脱后,用2%琼脂糖电泳检测.根据电泳初步定量结果,将PCR产物用QuantiFlourTM-ST蓝色荧光定量系统(Promega公司)进行检测定量,之后按照样品的测序量要求,进行相应比例的混合.表1常规分析项目及其所需仪器与方法Table1Analysisapparatusandmethods项目仪器文献NO3-_N/NO2--NNH4+-N瑞士万通861型离子色谱仪瑞士万通861型离子色谱仪[15][15]TOC、TN德国耶拿multiN/C3100型快速测定仪[15]pH值PHS－3CPH计[15]碳源表面形态日立s4300型扫描电子显微镜a注:a被微生物利用前的样品直接干燥噴金进行扫描电镜分析表面形态;被微生物利用后的样品用2.5%的戊二醛固定、酒精逐级脱水,然后自然干燥,最后噴金进行扫描电镜分析表面形态和微生物.Miseq文库构建与测序:用高通量测序平台IlluminaMiseq对扩增产物进Miseq高通量测序.Miseq测序得到的PEreads首先根据overlap关系进行拼接,同时对序列质量进行质控和过滤,区分样本后进行OTU聚类分析和物种分类学分析.生物多样性与分类学分析:首先将序列按照彼此的相似性归为操作分类单元(OTU).按照97%相似性对非重复序列(不含单序列)进行OTU聚类,采用RDPclassifier贝叶斯算法对97%相似水平的OTU代表序列进行分类学分析,并分别在各个分类水平:domain(域),kingdom(界),phylum(门),class(纲),order(目),family(科),genus(属),species(种)统计各样本的群落组成.2结果与分析2.1氮去除效果及出水TOC从图2中可知,挂膜阶段初期,氮去除率较高,可达到100%,这是由于玉米芯表面的可溶性碳源被微生物利用,碳源充足;随后氮去除率逐渐下降稳定至75%