高效反硝化菌aHD7的筛分脱氮特性及厌氧氨氧化性

高效反硝化菌aHD7的筛分、脱氮特性及厌氧氨氧化性*褚淑祎摇江惠霞摇肖继波**摇单胜道(浙江农林大学环境与资源学院,浙江临安311300)摘摇要摇从活性污泥中筛选出一株高效反硝化菌aHD7,30益静置培养3d,脱氮率可达91郾7%,且反应过程中亚硝酸盐积累量较低,3d后亚硝酸盐氮浓度基本稳定在1.8mg·L-1.显微镜观察显示,菌株为革兰氏阴性杆菌,大小为0.5滋m伊(1.5~2.5)滋m.通过生理生化特性及16SrDNA同源性分析,初步推断该菌株为门多萨假单胞菌(Pseudomonasmendocina).考察了碳源、C/N、氮初始浓度、pH等因素对菌株反硝化性能的影响.结果表明:对中低浓度硝酸盐(硝酸盐氮浓度臆276.95mg·L-1),脱氮率接近100%,硝酸盐氮浓度高达553.59mg·L-1时,脱氮率可达66.8%,且亚硝酸盐积累量甚微;最适碳源为乙醇;C/N为6~8和偏中性条件有利于反硝化反应.aHD7具有较强的厌氧氨氧化性,平均氨利用率达4.56mg·L-1·d-1.关键词摇反硝化菌摇筛选摇脱氮率摇厌氧氨氧化文章编号摇1001-9332(2012)11-3096-07摇中图分类号摇Q939.9摇文献标识码摇AScreening,denitrificationcharacteristics,andanaerobicammoniumoxidationabilityofde鄄nitrifyingbacteriumaHD7.CHUShu鄄yi,JIANGHui鄄xia,XIAOJi鄄bo,SHANSheng鄄dao(SchoolofEnvironmentandResource,ZhejiangAgricultureandForestryUniversity,Lin爷an311300,Zhejiang,China).鄄Chin.J.Appl.Ecol.,2012,23(11):3096-3102.Abstract:AhighlyefficientdenitrifyingbacteriumaHD7wasscreenedfromactivatedsludge.Afterstaticcultureat30益for3days,thedenitrificationrateoftheaHD7reached91.7%,andduringdenitrification,nitritehadloweraccumulation,withitsconcentrationbasicallymaintainedat1郾8mg·L-1.ThemicroscopyobservationdemonstratedthattheaHD7wasagram鄄negativebacillus,withanaveragesizeof0.5滋m伊(1.5-2.5)滋m.Basedonitsbiochemical/morphologicalcharac鄄teristicsandhomologicanalysisof16SrDNAsequence,theaHD7wasidentifiedasPseudomonasmendocina.TheinvestigationonthefactorsaffectingthedenitrificationcapacityofaHD7showedthatattheinitialconcentrationofnitratenitrogenbeinglessthan276.95mg·L-1,thedenitrifica鄄tionratewasalmost100%,andwhentheinitialconcentrationofnitratenitrogenwasashighas553郾59mg·L-1,thedenitrificationratecouldreach66.8%,withlittlenitriteaccumulated.Etha鄄nolwasthemostsuitablecarbonsource.C/Nratio6-8andpHvalue6-9benefitedthedenitrifica鄄tion.TheaHD7hadagoodabilityofanaerobicammoniumoxidation,anditsaverageammoniumutilizationratereached4.56mg·L-1·d-1.Keywords:denitrifyingbacterium;screening;denitrificationrate;anaerobicammoniumoxida鄄tion.*国家水体污染控制与治理重大科技专项(2008ZX07101鄄006鄄08)、浙江省重大科技专项(2009C03006鄄3)和温州招投标项目(F鄄GB201107110148,Z100602217)资助.**通讯作者.E鄄mail:[e-mail]2012鄄05鄄14收稿,2012鄄08鄄22接受.摇摇反硝化是微生物在厌氧或缺氧条件下将NO3-还原成N2O或N2的过程,具有能耗低、脱氮效率高、条件简单等特点,作为一种有效的脱氮技术被广泛用于氮素污染控制,是历年来的研究重点和热点[1-2].但是反硝化作用仅能利用NO3-,且由于反应过程中亚硝酸盐的积累导致反应时间较长[3],从而限制了其工程应用.付昆明等[4]研究发现,污水反硝化过程中出现了明显的亚硝酸盐积累,其浓度随着硝酸盐的不断还原而逐渐增加.厌氧氨氧化(anammox)是微生物在厌氧或缺氧应用生态学报摇2012年11月摇第23卷摇第11期摇摇摇摇摇摇摇摇摇摇摇摇摇摇摇摇摇摇摇摇摇摇摇摇摇摇摇摇摇摇ChineseJournalofAppliedEcology,Nov.2012,23(11):3096-3102条件下,将铵态氮(NH4+鄄N)和亚硝态氮(NO2-鄄N)同时转化为N2的过程,被认为是目前最具可持续发展的污水脱氮技术[5-6].厌氧氨氧化过程中提供电子供体的是NO2-,而非NO3-.因此,实现厌氧氨氧化过程须先积累NO2-.目前,NO2-的积累主要通过控制硝化过程中温度、溶解氧等条件实现,反应条件较严格,反应过程较不稳定[7].如何将反硝化过程和厌氧氨氧化有机结合起来,利用厌氧氨氧化去除反硝化作用中积累的亚硝酸盐,对于有效解决反硝化作用耗时长和厌氧氨氧化NO2-积累等问题、扩大反硝化的应用范围、扩充厌氧氨氧化菌源具有非常重要的意义.本文以驯化后的活性污泥为菌源,分离出一株高效反硝化菌aHD7,研究了该菌株对NO3-鄄N的降解特性,并对其厌氧氨氧化性进行了初步探讨.由浙江省微生物研究所对其形态、生理生化特性和16SrDNA同源性等进行分析鉴定.以期为今后该菌的工程应用提供基础数据和理论支撑.1摇材料与方法1郾1摇反硝化菌的筛选1郾1郾1菌源摇活性污泥取自浙江临安污水处理厂氧化沟.1郾1郾2培养基摇反硝化培养基:KNO32g、MgSO4·7H2O0郾2g、酒石酸钾钠20g、KH2PO40郾5g、蒸馏水1000mL、pH7郾2,加入2%(W/V)琼脂配制成固体培养基[8].Giltay培养基:A溶液,KNO31g、天冬酰胺1g、1%溴麝香草酚兰酒精溶液5mL、蒸馏水500mL;B溶液,柠檬酸钠8.5g、MgSO4·7H2O1g、FeCl3·6H2O0.05g、KH2PO41g、CaCl2·2H2O0.2g、蒸馏水500mL;以1颐1比例混合A、B溶液,调节pH至7.0~7.2[9].厌氧氨氧化培养基:KNO30.361g、MgSO4·7H2O0.2g、KH2PO40.5g、(NH4)2SO40.236g、蒸馏水1000mL.1郾1郾3活性污泥的驯化摇将400mL活性污泥置入加有600mL生活污水的烧杯中,加入KNO3,控制其浓度为50mg·L-1;以50r·min-1搅拌,控制溶解氧(DO)在0.5mg·L-1以下.每2d取样分析废水中硝态氮(NO3-鄄N)和总氮(TN),当NO3-鄄N和TN去除率分别达80%和75%以上时,按20%的比例逐步提高NO3-鄄N浓度,至进水NO3-鄄N浓度为320mg·L-1,当NO3-鄄N和TN去除率再次分别达到80%和75%以上时,则认为污泥驯化完成.1郾1郾4菌株的分离筛选摇取5mL驯化后的活性污泥于100mL灭菌后的反硝化培养基中,30益恒温密闭培养3d,并扩大培养3次.经平板划线分离数次,得纯菌.将其接种于灭菌后的反硝化培养基富集培养,至菌液浑浊,生长量达到对数期浓度(OD600值为0.1~0.45),即为菌悬液.将缠有细线的小试管(椎12mm伊75mm)倒扣于装有Giltay培养液的大试管(椎20mm伊200mm)中,并将小试管中的气体排净,塞住大试管,留部分细线在外,便于小试管的拉升,灭菌后待用.将活化后的菌株接种于Giltay培养液中,拉伸细线,使小试管提升一小段距离,以便收集气体.30益恒温密闭培养10d,每天观察培养液的变色情况及小试管中的气泡[10].根据产气量及培养基变色情况筛选出反硝化性能较强的菌株,并接种于反硝化培养基中,一定时间后检测TN去除率.1郾2摇菌株的鉴定1郾2郾1形态学分析摇菌株aHD7送由浙江省微生物研究所进行鉴定.接种于肉汤培养基,30益培养48h,对其菌落形态进行描述,通过光学显微镜对菌体形态进行观察.1郾2郾2生理生化鉴定摇依据《伯杰细菌鉴定手册》[11]、《常见细菌系统鉴定手册》[12]和《细菌属的鉴定指导》[13]进行鉴定.1郾2郾316SrDNA序列测定及同源性分析摇取1mL经37益振荡培养后的菌液于1.5mL离心管中,8000r·min-1离心1min,弃上清液.提取得到染色体DNA,以此为模板,使用16SrDNA序列通用引物进行扩增.扩增引物为:上游引物5忆鄄AGAGTTT鄄GATCCTGGCTCAG鄄3忆,下游引物5忆鄄AAGGAGGT鄄GATCCAGCCGCA鄄3忆.PCR反应体系:染色体DNA提取液0.5滋L、10伊PCR缓冲液5滋L、2.5mol·L-1dNTPs4滋L、10滋mol·L-1的上下游引物各0.5滋L,TaqDNA聚合酶0.25滋L,补重蒸水至50滋L.PCR反应条件:94益预变性2min,94益变性30s,57益退火45s,72益延伸60s,经过30个循环后,72益再延伸10min.对PCR产物进行割胶纯化,按Big鄄DyeTerminatorv3.1试剂盒说明对纯化产物进行核苷酸序列测定.1郾3摇菌株的反硝化性能研究1郾3郾1菌株aHD7反硝化过程和特性试验摇将菌悬液以5%的接种量接入反硝化培养基中,30益恒温密闭培养,每隔24h测定OD600、NO3-鄄N和NO2-鄄N.1郾3郾2碳源对反硝化性能的影响试验摇碳源类型对反硝化性能影响试验中,分别以葡萄糖、碳酸钠、柠790311期摇摇摇摇摇摇摇摇摇摇褚淑祎等:高效反硝化菌aHD7的筛分、脱氮特性及厌氧氨氧化性摇摇摇摇摇摇檬酸钠、乙醇、酒石酸钾钠作碳源,保持最终含碳量及其他成分不变;C/N对反硝化性能影响试验中,改变碳源乙醇含量,使培养液中C/N分别为4、6、8、10、12.1郾3郾3硝酸盐氮初始浓度对反硝化性能的影响试验摇以硝酸钾作氮源,调节培养液中硝酸盐氮初始浓度分别为69.34、138.48、276.95和415郾43mg·L-1.1郾3郾4pH的影响试验摇改变反硝化培养液pH为3、4、5、6、7、8、9、10.1郾4摇菌株的厌氧氨氧化性研究取10mL经活化后的反硝化菌悬液,接入100mL厌氧氨氧化培养基中,30益恒温密闭培养.分别于第10和15天采用5mL无菌注射器取样,检测NH4+鄄N、NO3-鄄N和NO2-鄄N,以不接种的培养液为空白对照.1郾5摇测定方法NH4+鄄N采用纳氏试剂分光光度法;NO3-鄄N、NO2-鄄N采用离子色谱法(ICS1500型,美国戴安公司);OD600采用浊度法.脱氮率计算:脱氮率=(1-cTIN1/cTIN2)伊100%,其中,cTIN1和cTIN2