高效液相色谱法1

第二十一章高效液相色谱法第一节概述高效液相色谱法(HighPerformanceLiquidChromat-ography；HPLC)是在60年代末，以经典液相色谱法为基础，引入了气相色谱的理论与实验方法，发展而成的。与经典液相色谱法的主要区别：•流动相改为高压输送•采用高效固定相•具有在线检测器•仪器化等。特点•分离效能高•分析速度快•应用范围广等1高效液相色谱法与气相色谱法应用范围对比气相色谱法虽然也具有快速、分离效率高、用样量少等优点，但它要求样品能够气化，从而常受到样品的挥发性限制。在约300万个有机化合物中，可以直接用气相色谱法分析的仅占20％。对于挥发性差或热不稳定的化合物，虽然可以采取预处理方法，但毕竟增加了操作上的麻烦，且常改变了样品原来的面目，还不易复原。高效液相色谱法分析对象广，它只要求样品能制成溶液，而不须气化。对于挥发性低、热稳定性差、分子量大的高分子化合物以及离子型化合物尤为有利。如氨基酸、蛋白质、生物碱、核酸、甾体、类脂、维生素、抗生素等。分子量较大、沸点较高的有机物以及无机盐类，都可用高效液相色谱法进行分析。2图21－1高效液相色谱仪示意图1．流动相贮瓶2．输液泵3．进样器4．色谱柱5．检测器6．废液出口或至级分收集器7．记录装置8．过滤器高效液相色谱法的优点：①适用范围广②分离性能好③分析速度快④流动杯可选择性范围宽⑤灵敏度高⑥色谱柱可反复使用⑦流出组分容易收集⑧安全。高效液相色谱法与经典液相色谱法对比对比如下表所示4表21－1高效液相色谱法与经典液相色谱法性能对比经典液相色谱高效液相色谱(分析型)固定相一般规格特殊规格固定相粒度(mm)75~5003~20固定相粒度分布(RSD)20%~305%柱长(cm)10~1007.5~30柱内径(cm)2~50.2~0.5柱入口压强(MPa)0.001~0.12~40柱效(每米理论塔板数)10~100104~106样品用量(g)1~10107~102分析所需时间(h)1~200.05~0.5装置非仪器化仪器化5第二节高效液相色谱法的分类与基本原理一、高效液相色谱法的分类高效液相色谱法的分类与经典液相色谱法相同。按固定相的聚集状态可分为•液液色谱法(LLC)•液固色谱法(LSC)按分离机制可分为•分配色谱法•吸附色谱法•离子交换色谱法•分子排阻色谱法•亲合色谱法•化学键合相色谱法•胶束色谱法等6HPLCLiquidSolidChromatographyLiquidLiquidChromatography(NormalandReversedphase)IonExchangeChromatography,IonChromatography,Amino-acidAnalysisBondedPhaseChromatography,PairedIonChromatography,IonSuppressionChromatographySizeExclusionChromatography,GelPermeationChromat-ography,GelFiltrationChromatographyAffinityChromatographyMicellarChromatographyChiralChromatography,CyclodextrinChromatographyCapillaryElectrophoresis,HighPerformanceCapillaryElectrophoresis,CapillaryZoneElectrophoresis,MicellarElectrokineticChromatographyCapillaryElectrochromatography,OpenTubularCapillaryElectrochromatography,PackedCapillaryElectrochromatography7二、基本原理高效液相色谱法与气相色谱法的主要差别是流动相的性质不同。因此，色谱理论中某些公式应用于HPLC时其表现形式或参数的含义有某些差别。学习本章，需认真复习第18章与第20章的基本慨念、保留值与分配系数的关系(式18·5)、差速迁移及塔板理论等内容，不再重述。本节重点介绍VanDeemter方程式在HPLC与GC中的表现形的区别，并简要介绍Giddings偶合式。8(一)VanDeemter方程式1．VanDeemter方程式在气相色谱法中的表现形式：•气一液色谱填充柱因传质阻抗近似等于液相传质阻抗项(CC1)，所以(21·1)•毛细管开口柱毛细管开口柱，只有一个流路，无多径项，A=0。因此，(21·2)9uCuBAH1/uCuBH1/2．VanDeemter方程式在液相色谱法中的表现形式VanDeemter方程式用于液相、气相色谱的区别，主要表现在纵向扩散项(B/u)及传质阻抗项(Cu)的差别上。VD方程式中的纵向扩散系数B=2rDm。Dm是被分离组分的分子在流动相中的扩散系数(在GC中，因流动相是气体，故在该章中用Ds表示)。在液相色谱中，流动相是液体，粘度(h)比气体大得多，柱温又比气相色谱低得多(LC多采用室温)，而DmT/h，因此液相色谱的Dm比气相色谱的Dm约小105倍。其次，为了节约分析时间，在液相色谱中，所采用的流动相的流速，一般至少是最佳流速的3～5倍。这些因素都促使纵向扩散项B/u减小，一般可忽略不计，于是在HPLC中：(21·3)uCAH1上式说明，在HPLC中，可以近似认为流动相的流速与板高成直线关系，A为截距，C是斜率。流速增大，板高增加，色谱柱柱效降低。为了兼顾柱效与分析速度，一般都尽可能地采用较低流速。内径(I.D.)4.6mm柱，流量多采用lml／min。流动相的流速对GC与HPLC板高影响的差别如下图所示。图21－2流动相流速对GC与HPLC的柱效影响对比1．B／u2．Cu3．A4．HPLC的u最佳5．GC的u最佳。涡流扩散项与传质阻抗项对柱效的影响，简要讨论如下：1．涡流扩散项在气相色谱中已介绍，A=2ldp(l:填充不规则因子)。为了使A减小，提高色谱柱柱效，可从两方面采取措施：①降低dp目前商品柱多采用3～5mm粒径的固定相。②降低l采用球形、窄粒度分布(RSD5％)固定相及匀浆装柱，球形固定相，除了能降低l外，还能增加柱渗透性，降低柱压。但固定相的粒度越小，越难装均匀，因此需采用高压、匀浆装柱法。3～5mm球形固定相，柱效一般为8~5104/m，可高达1105/m。122．传质阻抗系数传质阻抗项是传质阻抗系数与流动相流速之积。传质阻抗系数在HPLC与GC不同，在HPLC中传质阻抗系数由三个系数组成：(21·4)Cm、Csm及Cs分别是组分在流动相、静态流动相和固定相中的传质阻抗系数。在HPLC中，只有在使用厚涂层、并具有深孔的离子交换树脂的IEC中Cs才起作用。由于通常都采用化学键合相，它的“固定液”是键合在载体表面固定液官能团的单分子层。因此固定液的传质阻抗可以忽略。于是，C=Cm+Csm，替换式(21·3)中的C，得：(21·5)13ssmmCCCCuCuCAHsmm上式是VanDeemter方程式用于HPLC最常见的表现形式。该式说明，HPLC色谱柱的理论塔板高度，主要由涡流扩散项、流动相传质阻抗项和静态流动相传质阻抗项三项所构成。各种阻抗项对色谱峰展宽的影响如图21－3所示。14uCuCAHsmm图21－3涡流扩散与各种传质阻抗对液相色谱峰展宽的影响“x”号表示被分离组分的分子a．原始样品带宽b、c、d及e分别为经涡流扩散及各阻抗展宽后的谱带宽度3．应用VanDeemter方程式选择HPLC的分离条件这里主要讨论传质阻抗对板高的影响。Cm=C’m(dp2/Dm)Csm=C’sm(dp2/Dm)其中dp是固定相粒径，Dm是被分离组分分子的扩散系数。C’m与C’sm是两个比例系数。要降低Cm与Csm提高柱效，可从减小dp增大Dm入手。因DmT／h，故采用低粘度流动相或增加柱温都可增加Dm，而增加柱效。但在用有机溶剂为流动相的色谱法中，增加柱温易产生气泡，因此一般多在室温下进行实验。改善柱效主要靠采用低粘度流动相，还可以降低柱阻。例如，虽然甲醇对人体有害，却在HPLC中广泛使用，而很少用无害的乙醇。这是因为甲醇的粘度(0.6Pas)只有乙醇粘度一半的缘故。16由讨论VanDeemter方程式，所获得的选择HPLC分离条件的信息，可概括为：①采用小粒度、窄分布的球形固定相，首选化学键合相，用匀浆法装柱。②采用低粘度流动相，低流量(lml／min)。③柱温以25C为宜。太低，则使流动相的粘度增加。用水溶液为流动相的色谱法(如IEC等)可按需升温。17(二)Giddings偶合式简介Giddings认为VanDeemter方程式中影响塔板高度的各项因素，并不都是孤立的。而且证明了，涡流扩散项A与流动相传质阻抗项是偶合的。因为，一个分子不可能自始至终在一个流路中迁移，而保持在流路中心的分子与处于边缘的分子间的速度差不变(图21－3之C)。由于色谱柱中存在着径向(垂直于管壁的方向)扩散作用，在另一瞬间可能使分子进入到另一流路中，改变了在原流路中的速度差关系，甚至于相互抵消。因此，一组分子在一个流路中存在的迁移速度差所产生的流动相传质阻抗项(Cmu)，必然与由一组分子走多径所引起的涡流扩散项(A)相关联。由于它们之间存在着相互抵消作用，使它们对峰展宽的贡献，小于它们单独贡献之和。18Gidings导出了用涡流扩散项与流动相传质阻抗项倒数和的倒数表示的偶合作用，于是：(21·6)(21·7)HA称为偶合项。Giddings偶合式通式说明塔板高度由HA、Hd、Hsm和Hs四项组成。在一般高效液相色谱法中H=HA+Hsm；在填充气相色谱法中H=HA+Hd+Hs，各符号的含义同前。19uCuCuBuCAHssm1m/11ssmdAHHHHH第三节各类高效液相色谱法本节主要介绍药物分析中最常用的化学键合相及吸附色谱法等。一、液固吸附色谱法(LSC)流动相为液体，固定相是固体吸附剂，简称液固色谱法。1．分离机制吸附色谱是被分离的组分分子(溶质分子)与流动相分子争夺吸附剂表面的活性中心，靠溶质分子的吸附系数的差别而分离，如图18－3所示。已经介绍吸附系数可用广义分配系数K代替。因为溶质分子只吸附于吸附剂表面，而不能进人其内部，于是：tR=t0(1+KS／Vm)(21·8)tR=t0(1+KS／Vm)(21·8)其中的S是色谱柱中吸附剂的表面积，其它含意同前述。在吸附色谱法中，选择实验条件务必使组分间的分配系数K产生差别。由于S不易测，因为容量因子k=K·S／Vm，所以一般都用k代替K讨论问题。2．影响容量因子的因素在色谱柱一定(S与Vm一定)及柱温一定时，k与溶质及溶剂的性质有关。在吸附色谱法中，硅胶是最常用的吸附剂，故以硅胶为例讨论。(l)硅胶与溶质分子的亲合力顺序(容量因子序)；饱和烃＜芳烃＜有机卤化物＜硫醚＜醚＜硝基化合物＜酯醛酮＜醇胺＜砜＜亚砜＜酰胺＜羧酸。与硅胶亲合力大的溶质，k大，tR’(或tR)大，晚出柱。21(2)溶质的极性：在用硅胶为固定相的液一固色谱法中，常用流动相是以烷烃为底剂加入适当极性调整剂组成的二元或多元溶剂系统。溶剂系统的极性越大，洗脱力越强，容量因子k及tR越小。调整溶剂的极性，可控制组分的保留时间。需要说明一点，硅胶遇水容易失去吸附活性，但微量水可改善某些拖尾状况(减尾剂)。若硅胶含水量超过某限度(有17％之说)，则完全失活，而变成分配色谱，此时水为固定液。因此，在用硅胶柱进行吸附色谱分析时，必须使用不含水的流动相。硅胶除作为吸附剂应用外，更主要的是作为键合相的载体(或称基体)。22二、液一液分配色谱法(LLC)流动相与固定相都是液体的色谱法，或液液分配色谱法。1．分离机制靠样品组分溶入固定相(s)与流动相(m)达到“平衡”后分配系数(狭