海水培养光合细菌存在的问题及其优化研究

海水培养光合细菌存在的问题及其优化研究摘要[目的]为光合细菌海水培养技术的大规模应用提供理论依据。[方法]采用对比试验研究光合细菌在不同培养基中的生长状况,探讨光合细菌在海水培养过程中出现沉降现象的原因,在此基础上对培养基组分进行优化并进行优化培养试验。[结果]在海水培养光合细菌的过程中,酵母膏、蛋白胨培养基中沉降现象较轻,其余培养基中培养2d后均出现较严重的沉淀现象,主要是因为培养过程中培养基的pH值逐渐升高,其中的磷酸盐与海水中的Ca2+和Mg2+结合成沉淀,从而使细菌附着在沉淀表面生长所致。优化后的培养基组分为:乙酸钠3.0g/L,氯化铵1.0g/L,磷酸二氢钾0.1g/L,酵母浸膏0.5g/L。[结论]用优化后的培养基培养光合细菌效果理想,培养7d后光合细菌的个数可达3.16@109个/ml。关键词光合细菌;海水;培养ProblemofPhotosyntheticBacteriaCultureinSeawaterandOptimizationofCultureConditionsAbstract[Objective]Theaimwastoprovidetheoreticalbasisfortheapplicationofculturetechnologyforphotosyntheticbacteriainseawaterinlargescale.[Method]Thecontrasttestwastakentostudythegrowthstatusofphotosyntheticbacteriaindifferentmediumsandtoexplorethereasonofphoto-syntheticbacteriaappearingsubsidencephenomenoninseawaterincultureprocess.Onthebasisofit,themediumcomponentswereoptimizedandtheop-timizedculturewascarriedout.[Result]Intheprocessofphotosyntheticbacteriacultureinseawater,thesubsidencephenomenoninyeastextractandpeptonemediumwasslightandthatinothermediumswasseriousafterculturedfor2d.Themainreasonwasthat,withthegraduallyriseofpHvalueofmediumincultureprocess,thephosphatecombinedintoprecipitationwithCa2+andMg2+inseawater,sothebacteriaattachedtotheprecipitationtogrown..Theoptimizedmediumwasthatsodiumacetateof3.0g/L,chlorideof1.0g/L,potassiumdihydrogenphosphate0.1g/L,yeastextract0.5g/L.[Conclusion]Thecultureeffectofphotosyntheticbacteriawithoptimizedmediumwasideal,andthenumberofphotosyntheticbacteriacouldreach3.16@109ind/mlafterculturedfor7d.KeywordsPhotosyntheticbacteria;Seawater;Culture光合细菌(PhotosyntheticBacteria,PSB)是一类能在厌氧光照或好氧黑暗条件下利用有机物作供氧体兼碳源,进行不放氧光合作用的有益细菌,不仅可作为光合作用机理和产氢固氮的研究材料[1-2],且在养殖业、种植业、环境治理和新能源开发利用等领域具有广阔的应用前景[3-8]。在水产养殖中,光合细菌可降解水体中的有机质和硫化物等有毒物质,实现其充当饵料、净化水质、预防疾病和作为饲料添加剂等的功能,因此光合细菌在无公害水产养殖中具有巨大的应用价值[10]。目前生产上应用较多的是紫色非硫细菌中的沼泽红假单胞菌(Rhodopseudomonaspalusteris)和类球红细菌(Rhodobacterspheroids),市面上所售菌种大都适合淡水培养,而用海水培养光合细菌时,因为海水中含有大量的钙、镁等物质,极易与培养基中的PO43-、HPO42-形成Ca3(PO4)2、CaHPO4等沉淀,导致细菌在沉淀表面生长,出现严重的沉降现象。为此,笔者进行了大量试验,找出了适合光合细菌在海水中生长的培养基,并采用正交试验优化了培养基中各组分的最佳配比,为光合细菌海水培养的大规模应用奠定了基础。1材料与方法1.1材料1.1.1菌种。所用菌种主要是沼泽红假单胞菌,来源于江西宜春强微高新技术专利开发中心。1.1.2仪器。WFJ-72型可见分光光度计,PHS-3C型精密pH计,YXQ-LS-50S立式压力蒸汽灭菌器。1.1.3培养基。培养基选择试验采用5种培养基:小林达治培养基的红螺菌科配方(培养基1)、Sawad培养基(培养基2)、失木修身培养基(培养基3)、VanNiel培养基(培养基4)、酵母膏、蛋白胨培养基(培养基5)[9]。1.2试验方法1.2.15种培养基的比较。将菌种以20%接种量接种到分别用自来水和海水配制的上述5种不同的培养基中,在其他因素(温度、光照、氧需求程度等)相同的条件下进行培养。培养过程中每天震荡摇匀3~5次,在660nm处测定菌液的吸光度值(OD660)来表示菌体含量,并每天测定1次pH值,以观察细菌培养繁殖过程中菌液的pH值变化。图1光合细菌在自来水中的生长曲线Fig.1Thegrowthcurveofphotosyntheticbacteriaintapwater1.2.2培养基组分的优化设计。为解决海水培养光合细菌的沉降凝聚问题,参照细菌在培养过程中所需要的碳源、氮源、磷源和其他生长因子[4,9-12],结合海水的特点,对光合细菌生长的培养基进行了改良,同时考虑各因素间的相互作用,采用正交试验设计L8(27)[13],对培养基中各组分进行优化。安徽农业科学,JournalofAnhuiAgri.Sci.2009,37(5):1901-1902,1918责任编辑常俊香责任校对张士敏图2光合细菌在海水中的生长曲线Fig.2Thegrowthcurveofphotosyntheticbacteriainseawater2结果与分析2.1几种培养基的比较在淡水中,除VanNiel培养基和酵母膏、蛋白胨培养基培养的PSB出现菌液颜色不正常(变成橙红色),菌液发臭,菌体粘壁现象外,其他3种培养基培养的PSB生长正常,菌液紫红,均匀、粘稠成胶体状,结果见图1、图2。出现这种现象的原因:从培养基的成分上看,5种培养基的氮源都是氯化铵或硫酸铵,磷源都是磷酸二氢钾或磷酸氢二钾,碳源有所不同。VanNiel培养基和酵母膏、蛋白胨培养基的碳源是蛋白胨,其他3种培养基的碳源主要是乙酸钠。乙酸钠作为小分子有机物,更适合光合细菌的生长,而蛋白胨作为碳源出现上述现象可能是因为蛋白胨同时也是其他菌种的营养物质,使其他菌种成为优势菌,PSB生长受到抑制,出现菌液不正常现象。在海水中,酵母膏、蛋白胨培养基沉降现象比较轻,但出现了严重的粘壁现象,其余培养基均在2d后出现严重的沉降现象,后续生长缓慢。这主要是由于其余4种培养基中都含有不同量的磷酸氢二钾和磷酸二氢钾,pH值的大小决定了这些磷酸盐在培养体系中的存在形式,当pH值为6时,分布系数DHPO42-=0.058,磷酸盐主要以HPO42-的形式存在;pH值为8时,DPO43-=0.86,磷酸盐主要以PO43-的形式存在。而在PSB培养过程中培养基的pH值逐渐升高(培养第1~8d时,pH值分别为6.55、6.80、7.86、8.28、8.35、8.55、8.48、8.79),磷酸盐主要以HPO42-和PO43-的形式存在,而HPO42-、PO43-极易与海水中大量存在的Ca2+形成Ca3(PO4)2、CaHPO4沉淀(KspCa3(PO4)2=2.0@10-29,KspCaHPO4=1.0@10-7),细菌就会附着在沉淀表面生长繁殖,造成菌液不均匀。其次,海水中含有较多的钙盐和镁盐,这些盐类的存在,破坏了光合细菌胶体的稳定性,加剧了凝聚沉降现象的发生。2.2培养基组分的优化要防止菌悬液沉降,必须严格控制培养基的pH值和磷源的加入量,为此,笔者在充分查阅相关资料和初步试验的基础上[4,10-13],对光合细菌的培养基进行了改良和培养基组分的优化(表1)。从正交试验的直观分析结果来看,影响细菌生长的主要表1培养基各组分的正交设计L8(27)Table1ThedesignofL8(27)orthogonaltestforeachcomponentinmedium列号No.ofcolumnA(乙酸钠)SodiumacetateB(氯化铵)AmmoniumchlorideC(磷酸二氢钾)PotassiumdihydrogenphosphateD(硫酸镁)MagnesiumsulfateE(pH)C@EF(酵母浸膏)YeastextractOD5-OD011(3.0)1(1.0)1(0.1)1(0.0)1(6.5)11(0.5)1.66421(3.0)1(1.0)1(0.1)2(0.5)2(7.5)22(1.0)1.61931(3.0)2(2.0)2(0.3)1(0.0)1(6.5)22(1.0)1.67741(3.0)2(2.0)2(0.3)2(0.5)2(7.5)11(0.5)1.31852(2.0)1(1.0)2(0.3)1(0.0)2(7.5)12(1.0)1.40662(2.0)1(1.0)2(0.3)2(0.5)1(6.5)21(0.5)1.55472(2.0)2(2.0)1(0.1)1(0.0)2(7.5)21(0.5)1.42682(2.0)2(2.0)1(0.1)2(0.5)1(6.5)12(1.0)1.506K16.3486.2136.1856.0436.2726.0646.132K25.8926.0276.0556.1974.5633.0034.602极差R0.4560.1860.1300.1541.7083.0611.530因素主y次FactorsrankingC@EEFABDC优方案OptimumschemeA1B1C1D2E1F1注:OD0、OD5分别表示培养当天和第5天菌悬液在660nm处的吸光度。Note:OD0andOD5standfortheabsorbencyofbacterialsuspensionatthewavelengthof660nmonthesamedayandthefifthdayafterculture.因素是磷酸二氢钾和pH值的交互作用,其次是pH值,这与前面的分析结果相吻合。影响培养结果的因素依次为:C@EyEyFyAyByDyC,由于硫酸镁的2水平之间没有显著差异,海水中又含较多Mg2+(约1.29g/L),所以最终选择的优化方案是A1B1C1D2E1F1。2.3培养基组分优化后的培养效果用优化后的培养基对光合细菌进行扩大培养,每天测定菌悬液的吸光度值(OD660),并用乙酸和NaOH调节pH值在6.5~7.0之间。同时在相同温度、光照条件下,选择2种情况相比较:(1)选择优化后的培养基,但在培养过程中不调pH值;(2)选择优化后的培养基,但培养基中不加磷酸盐。培养结果见图3。由图3可知,用优化后的培养基培养的光合细菌生长状况良好,7d后用MPN法[14]测定光合细菌的个数达到3.16@109个/ml。用优化后但不调pH值的培养基培养光合细菌时,由于2d后菌液pH值升高,出现明显的沉