石油生物降解的机理研究

1石油污染物生物降解的机理研究李会爽1，周磊2，柳青2，张端2，张景来2摘要：通过测定石油生物降解过程中的产物，分析探寻假单胞菌属的Pseudomonassp.StrainSY2对石油的降解机理，为解决海洋石油污染问题提供理论依据。本文利用色质谱分析手段，通过测定假单胞菌属的Pseudomonassp.StrainSY2对石油和正十四烷降解产物，对菌株SY2的降解机理进行分析研究。实验（分析）结果表明：菌株SY2对石油中的正烷烃有较好的降解效果，其中正十四烷、正十五烷和正十六烷的降解率较高，分别为：73.4%、49.3%、48.9%；根据正十四烷降解产物推测：菌株SY2对正十四烷的降解有单末端氧化、双末端氧化、次末端氧化和直接脱氢等多种途径，产生酯类、烯烃类、烷烃类及羧酸类等物质，与文献报道的烷烃降解途径相符合。关键词：石油污染，生物降解，降解途径StudyonTheoryofBiodegradationofOilContaminationLIHui-shuang,ZHOULei,LIUQing,ZHANGDuan,ZHANGJing-laiAbstract:,InordertofindthetheoriesofbiodegradationaboutcrudeoilandtetradecanebyPseudomonassp.StrainSY2andprovidesatheoreticalbasisforthesolutionofoilcontamination,theresearchanalysesthestructureofthesubstancesfrombiodegradationofcrudeoil.Inthispaper,throughanalyzingstructureofthesubstancesfrombiodegradationofcrudeoilandtetradecanebyPseudomonassp.StrainSY2,whichdetectingbyGC/MS,theauthorstudiedthetheoriesofbiodegradation.TheresultsindicatethattheabilityofSY2fordegradingn-alkanesisbest;inwhichthedegradationrateofpentadecane49.3%,hexadecane48.9%andtetradecane73.4%arehighest.Accordingtothesubstancesfromprocessoftetradecanebiodegradation,theauthorinferredthattetradecanebiodegradedtoesters,olefins,alkanesandcarboxylicacidsbyavarietyofbiodegradationpathways,suchasmonoterminaloxidation,diterminaloxidation,dehydrogenationandsoon,whichtallieswithalkanedegenerationwayrepotedbythedocuments.KeyWords：Oilcontamination,Biodegradation,Biodegradationpathway1前言石油是人类非常宝贵的自然能源。然而在石油带给人类巨大利益的同时，其开采、2运输中频发的事故也给人类赖以生存的自然环境带来了严重的污染。石油污染的治理中，生物降解技术具有经济、高效、无二次污染的优点，目前已成为石油污染特别是海洋石油污染治理研究的热点。目前，在生物法治理石油污染研究的领域中，主要集中在分离优势石油降解菌[1,2,3,4]，并进行菌属鉴定和对影响降解率因素的考察方面[5,6,7]，关于菌株对石油烃降解机理研究的相关报道较少。本实验通过色质谱分析手段，对菌株的降解途径进行初步研究，以充实石油烃降解机理研究领域的某些空白。2材料与方法2.1实验材料2.1.1菌种与培养基本实验所用菌种是假单胞菌属的Pseudomonassp.StrainSY2(以下简称为SY2)。该菌株是由燕山石化供油站的土壤中分离所得的高效石油降解菌。培养基成份：NaCl5g/L；NaNO31g/L；KH2PO41g/L；琼脂15g/L；pH7.2；蛋白胨10g/L。2.1.2共试样品大庆原油，正十四烷。2.1.3实验设备TRACEGC-DSQ(GC/MS)型气质联机；3700GC型气相色谱仪；HZS-H型空气浴摇床；752型紫外分光光度计。2.2实验方法由于原油成分的复杂性，直接用原油进行降解途径的研究难度太大，因此在研究原油降解的同时也选用了一种纯物质正十四烷进行研究。本实验研究菌株SY2的降解途径。实验设计如表1所示。表1降解途径实验设计表锥形瓶标号1234油样石油石油空白正十四烷正十四烷空白接种与否接种未接种接种未接种根据表1接种SY2菌液，2、4锥形瓶做空白对照。将锥形瓶放入30℃、160r/min3的空气浴摇床中培养120h后用二氯甲烷萃取，此外分别做石油和正十四烷的标准二氯甲烷溶液作为对照。用色质联机（GC/MS）对含有正十四烷的样品进行定量、定性分析；用气相色谱仪对含石油的组分进行定量检测，并以标准谱图对其组分进行定性分析。由色谱峰的面积计算总降解率、物理化学降解率和菌株的生物降解率；根据降解过程中的产物确定降解途径。色质谱分析条件：色谱柱为石英毛细管柱(30m×0.25mm×0.25um)，载气为He气；柱流量1mL/min；质谱定性检测；进样量为1µL；柱温为程序升温30℃(10min)→100℃时，升温速率为5℃/min，100℃→200℃时，升温速率为20℃/min，200℃→280℃时，升温速率为30℃/min，尾吹10min。色谱分析条件：色谱柱为石英毛细管柱(30m×0.22mm×0.5um)，载气为N2气；检测器为氢火焰离子化检测器，温度为330℃；进样量为4µL；柱温为程序升温30℃(2min)→100℃(5min)→200℃(10min)→300℃时，升温速率均为5℃/min，至峰出完为止。3结果与讨论3.1石油的降解石油样品的色谱图如图1-3所示。图1石油标准色谱图T/min4图2石油降解后的色谱图图3石油空白对照色谱图5根据标准谱图对其组分进行定性分析，并根据色谱图的峰面积计算各物质的降解率。结果如表2所示。表2石油中各物质的降解率标号物质名称总降解率(%)理化降解率(%)生物降解率(%)1正十四烷73.421.851.62正十五烷49.35.145.23正十六烷48.96.542.44正十七烷38.16.231.95正十八烷27.24.722.56正十九烷20.13.816.37正二十烷28.26.321.98正二十一烷28.45.822.69正二十二烷33.76.527.210正二十三烷37.912.225.711正二十四烷43.014.228.812正二十五烷43.818.625.213正二十六烷39.219.120.114正二十七烷33.611.421.215正二十八烷26.39.816.516正二十九烷16.35.311.017正三十烷10.32.47.918正三十一烷0.0040.0040.0002由上述分析可见，SY2对石油中正构烷烃的降解能力较好。对正十四烷、正十五烷和正十六烷的降解率较高。不同碳链长度的正构烷烃的降解率不同：随着碳链的增长，由正十四烷到正十九烷降解率逐渐减小，由正十九烷到正二十二烷降解率逐渐增大，此后至正三十烷降解率逐渐减小，对正三十一烷基本没有降解。3.2正十四烷的降解由于正十四烷的色谱峰太大，它掩盖了其它的较小的色谱峰。各部分放大后的正十四烷样品色谱图如图4-5所示。6图4正十四烷标准色谱图图5正十四烷降解后的色谱图7图6正十四烷空白对照色谱图由质谱鉴定峰1为样品中正十四烷的色谱峰。由图1-3可以看出菌株SY2对正十四烷具有明显的降解作用，降解率如表3所示。表3菌株SY2对正十四烷降解率总降解率理化降解率生物降解率76.50%25.79%50.71%在图2中找出图1和图3中没有的色谱峰，即菌株降解过程中及降解后的产物，如表4所示。表4菌株降解过程中及降解后产物保留时间(min)2.49-2.522.62-2.643.82-3.8312.74-12.75分子式C4H8O2C4H8OC6H14C6H10O4结构式烷烃降解的途径主要是单末端氧化、双末端氧化、次末端氧化和直接脱氢[8,9]。根据烷烃的降解途径和正十四烷的降解产物推测菌株SY2降解正十四烷的途径：正十四烷的降解产物C4H8O2、C4H8O、C6H14和C6H10O4的炭链长度均较短，且炭为偶数，推测是经过多次次末端氧化所致；产物含有－C=C双键、羟基、羧基和酯，推测反应过程为：OOOHOHOOHO8其中的C4H8O2推测可能为反应产物乙酸和反应中间产物乙醇之间的相互反应产生。4结论从以上的分析讨论可以看出，菌株SY2对石油中的正构烷烃有较好的降解能力，对不同碳链长度的正构烷烃的降解率不同，对正十四烷、正十五烷和正十六烷的降解率较高；SY2降解正十四烷的过程中主要为次末端氧化，还有单末端氧化、双末端氧化，可能含有直接脱氢的过程。参考文献[1]MOBENKA-COKER,JAEKUNDAYO.APPLICABILITYOFEVALUATINGTHEABILITYOFMICROBESISOLATEDFROMANOILSPILLSITETODEGRADEOIL[J].ENVIRONMENALMONITORINGANDASSESSMENT.1997,45(3):259-272.[2]金樑,谢思琴,顾宗濂等．石油降解菌的分离、鉴定及其降解能力的研究[J]．应用环境生物学报，1999，(5)：127-129．[3]APRILTM,ABBOTTSP,FOGHTJM.DEGRADATIONOFHYDROCARBONSINCRUDEOILBYTHEASCOMYCETEPSEUDALLESCHERIABOYCLII[J].CANJMCROBIOL.1998,44(3):270-278.CH3－C12H24－CH3次末端氧化CH3－C10H20－CH2OH＋CH3COOHCH3－C4H8－CH2OH＋3CH3COOH次末端氧化末端氧化………双末端氧化HOOC－C4H8－COOH末端脱水HOCH2－C2H4－CH2OH＋CH3COOH双末端氧化中间产物H2C＝CH－CH－CH2OH直接脱氢9[4]MJBDDESOUZA,SNAIR,JJDAVID,DCHANDRAMONHAN.CRUDEOILDEGRADATIONBYPHOSPHATE-SOLUBILIZINGBACTERIA[J].JOURNALOFMARINEBIOTECHNOLOGY.1996,4(2):91-95.[5]丁明宇，黄健，李永祺．海洋微生物降解石油的研究．环境科学学报[J]．2001，1.21(1)：84-88．[6]NMFAYAD,EOVERTON.AUNIQUEBIODEGRADATIONPATTERNOFTHEOILSPILLEDDURINGTHE1991GULFWAR[J].MARINEPOLLUTIONBULLETIN,1995,30(4):239-246.[7]RMARGESIN,FSCHINNER.EFFECTOFTEMPERATUREONOILDEGRADATIONBYAPSYCHROTROPHICYEASTINLIQUIDCULTUREANDINSOIL[J].FEMSMICROBIOLOGYECOLOGY,1997,24:243-249.[8]任南琪，马放，于秀娟等．污染物控制微生物学．哈尔滨：哈尔滨工业大学出版社，2002：134-158．[9]夏北成．环境污染物生物降解．北京：化学工业出版社，2002：179-184．