微生物实验指导

实验一微生物培养基的配制和灭菌培养基是将微生物生长繁殖所需要的各种营养物质，用人工方法配制而成的各种营养基质。它具有微生物正常生活所需的各种养料和适宜的环境条件：(1)适当组分和比例的营养物质；(2)适宜的pH值；(3)合适的渗透压；(4)保持无菌状态。所以培养基是培养微生物所必需的最主要材料。培养基的配制是微生物工作者的主要技术操作之一。一、实验目的与耍求：1．了解培养基的配制原理和方法，掌握其配制过程。2．了解几种灭菌方法，掌握干热灭菌法和加压蒸汽灭菌法的原理及其使用方法。3．熟悉分离、培养微生物前的有关准备工作及操作方法。二、实验原理与材料：(一)培养基的种类根据培养基的组成成分，可将培养基分为三类：合成培养基：由各种纯化学物质按一定比例配制而成。半合成培养基：由一部分纯化学物质和另一部分天然物质配制而成。天然培养基：利用天然来源的有机物配制而成的。从培养基的物理状态来分：液体培养基：不加凝固剂。固体培养基：在液体培养基中加2％左右的凝固剂。半固体培养基：在液体培养基中加入0.2％一0.5％凝固剂。微生物最常用的凝固剂为琼脂(其次为明胶)，又叫洋菜、冻粉。它不是一种营养物质，只能被极少数种类的细菌分解利用。琼脂是从海藻中(主要是石花菜)提取而制成的。是一种多糖类化合物，主要成分是复杂的多糖硫酸酯钙盐，琼脂是一种可逆性胶体，在常规浓度下加热到96℃以上即成溶胶状态，融化的琼脂，当温度下降到42℃以下，又凝固为固体。表3-1琼脂与明胶特性比较比较项目琼脂明胶比较项目琼脂明胶熔点(℃)凝固点(℃)酸碱度灰分(％)氧化钙(％)氯化镁(％)氮(％)9640微酸16.01.15O.77O.402520酸性14.0—15.00.00.018.3微生物可利用性耐热性来源化学本质常用浓度（％)绝大多数微生物不能水解利用强植物多糖1.5—2部分微生物能水解利用弱动物蛋白质5一12（二）实验材料1．药品：牛肉膏、蛋白胨、氯化钠、琼脂；马铃薯，蔗糖；可溶性淀粉、K2HPO4、KN03，MgS04·7H20、FeSO4·7H20、等。2．高压蒸汽灭菌器、恒温干热灭菌箱、细菌过滤器、紫外线杀菌。3．其它：天平、牛角匙、电炉、1NHCl、1NNaOH、pH试纸、刻度搪瓷杯、量筒、漏斗、漏斗架、玻棒、带玻璃珠的三角瓶、带棉塞的无菌试管、无棉塞的空试管、培养皿、吸管、各种包装纸、防水纸、绳索、棉花、标签等。三、实验方法与步骤：(一)、培养基的配置1．培养基的配制常用方法和步骤：(1)称量：按照培养基配方，正确称取各种原料放于搪瓷杯中。(2)溶化：在搪瓷杯中加入所需水量(根据实验需要加入蒸馏水或自来水)，用玻棒搅匀，加热溶解。(3)调pH值(调pH也可以在加琼脂后再调)，用1NNaOH或1NHCl调pH，用pH试纸对照。(4)加琼脂熔化，在琼脂熔化过程中，需不断搅拌，并控制火力不要使培养基溢出或烧焦，待完全熔化后，补足所失水分，一般数量少，时间短不必补水。(5)分装：在漏斗架上分装。根据不同的需要进行分装，一般制斜面的装量为管高的五分之一。特别注意不要使培养基粘污在管(瓶)口上以免浸湿棉塞，引起污染。(6)包扎成捆、挂上标签。培养基分装好后，塞上棉塞，用防水纸包扎成捆，挂上所配培养基名称的标签。(7)灭菌备用。灭菌后如需制成斜面的，应在下磅后取出，摆成斜面，(见图3一1)。培养基经灭菌后，必须放在37℃恒温培养箱中培养24小时，如确无菌生长，方可使用。2．三种培养基的配方及配制（1）.牛肉膏蛋白胨琼脂培养基(用于分离和培养细菌，是一种天然培养基)。配方：牛肉膏3克蛋白胨5克氯化钠3克琼脂20克自来水1000毫升pH7．2～7．4灭菌15磅／英寸2，30分钟。本实验将原配方配成各种浓缩液。各种浓度如下：30％牛肉膏、50％蛋白胨，30％氯化钠。以配制200毫升培养基为例：吸取30％牛肉膏2毫升，50％蛋白胨2毫升，30％氯化钠2毫升，加入有刻度的搪瓷烧杯中，然后用自来水补足到200毫升。用玻捧搅匀，在电炉上稍加热，调pH至7.4，加琼脂4克，加热熔化，用玻棒不断搅拌，至琼脂完全溶解为止，趁热在漏斗架上装试管，(见图3—2)。装带有棉塞的无菌试管，装置五分之一的试管高度共12支，作斜面培养基。用铝壳试管帽的各装10毫升，约试管高度的二分之一以上，用作分离时倒平板用。分装完毕，以12支为一捆，用防水纸包扎成捆，(图3—3)挂上标签，灭菌备用。（2）．马铃薯(或豆芽汁)蔗糖(或葡萄糖)琼脂培养基。(用于分离和培养真菌之用，是一种半合成培养基)。配方：去皮马铃薯(或鲜豆芽)200克蔗糖(或葡萄糖)20克自来水1000毫升琼脂20克pH自然灭菌：(含蔗糖)15磅／英寸230分钟。(含葡萄糖)10磅／英寸220分钟。制备方法：配制200毫升培养基。取去皮马铃薯40克，切成小块，放入无刻度的搪瓷杯中，加水200毫升，置电炉上加热，煮沸十分钟，用四层纱布过滤至具刻度的搪瓷杯中，滤液加水补足至200毫升，然后加蔗糖4克，加琼脂4克，加热熔化，并用玻棒不断搅拌，直至琼脂完全熔化，分装试管，下面一系例步骤同配细菌培养基相同。（3）淀粉琼脂培养基(高氏一号Gause’S1)，用于分离和培养放线菌之用，是一种合成培养基。配方：可溶性淀粉20.O克KN031.0克K2HP04O.5克MgS04·7H20O.5克NaClO.5克FeS04·7H20，O.01克琼脂20克自来水1000毫升灭菌：15磅／英寸2，30分钟。制备方法：配制200毫升培养基吸取配方液：1％KN0320毫升；l％K2HP04lO毫升；l％MgSO4·7H2OlO毫升；l％NaCl10毫升；1％FeSO4·7H2OO.2毫升，加水补足至200毫升，置电炉上加热。用另一只搪瓷杯称取可溶性淀粉4克，从200毫升中取出少量加入淀粉中，用玻棒调成糊状，待液体沸腾后，将淀粉糊洗入培养液中，搅匀，取下调pH至7.4，加琼脂4克，加热至琼脂完全熔化为止，趁热分装试管，下面一系例步骤同于配制细菌培养基的操作方法。（4）．无菌水的制备：无菌水，为下一次微生物分离实验中所需用的材料。100毫升三角瓶(装有玻璃珠)，装自来水45毫升，试管中装9毫升自来水，塞上棉塞，包扎、灭菌备用。三角瓶和试管须预先塞好棉塞，并经干热灭菌。(二)分离培养微生物常用器皿的准备1．清洗一些玻璃仪器：如三角瓶，试管，培养皿、吸管等。2．棉塞的制作：装培养基和分离培养需用的部分玻璃器皿，需加棉花塞。棉塞的作用为过滤空气，使试管内外空气可以流通，但外界空气中杂菌不能进入，避免污染。试管、三角瓶都要做棉塞。吸管上部也要塞入棉花，在管口约l～2毫米处，用解剖针塞入少许棉花，(约1—1.5厘米长)，以防止细菌吸入口中，并避免将口中细菌吹入管内。棉花要塞得松紧适宜。吹时以能通气但不使棉花滑下为准。教师示范做试管棉塞，同学每人做5支试管棉塞。棉塞要求不紧不松，两头光滑，试管棉塞的长度约3厘米左右。塞入试管内部分约占2／3，头部稍大约占l/3左右，见图3—4。12345.图3-4棉塞的要求条件1.正确的式样2.管内部太短，管外太松3.管外太小4.整个棉塞过松5.管内部太紧，管外太松3．包装培养皿和吸管等。为了使培养皿、吸管，三角玻棒等洗净，干热灭菌后，不让表面暴露，以保证无菌状态，为此干热灭菌前先用旧报纸包装妥当(见示范)，每组同学包培养皿6只(一包)。吸管的包装，将塞好棉花的吸管尖端，放在4～5厘米宽的长纸条的一端，约成45º角，折叠纸条，包住吸管尖部，用左手握住移液管身，右手将移液管压紧，在桌面上向前搓转，以螺旋式包扎起来。上端剩余纸条，折叠打结，准备灭菌。见图3—5。(三)培养基和玻璃器材的灭菌方法灭菌的方法，通常可以分为四大类：(1)加热灭菌：包括直接灼烧灭菌、干热灭菌、加压蒸汽灭菌、间歇灭菌和煮沸消毒；(2)过滤去菌；（3）射线灭菌和消毒；(4)化学药剂灭菌和消毒。在本实验中，以介绍与培养基和玻璃器材灭菌有关的部份灭菌方法。1．干热灭菌法(即热空气灭菌法)：干热灭菌—般是利用电热烘箱作为干热灭菌器。前面所包装好的玻璃器皿，如带棉塞的三角瓶，试管、包装好的吸管、培养皿等，放入电热烘箱中。打开烘箱顶部的通气孔，接上电源加热，使箱内空气的温度达到160℃一170℃，关闭通气孔，使箱内的温度保持在160℃左右，并维持1.5—2小时。时间一到，切断电源。待温度下降至60一70℃以下，方可打开箱门取灭菌物品，否则骤冷后易使箱内玻璃仪器破损。2．加压蒸汽灭菌法利用高压灭菌器，使水的沸点在密闭的灭菌器内随压力升高而增高(见表3—2)，来提高蒸汽的温度和灭菌的效率。蛋白质含水量(%)凝固温度(℃)5025186O5674—8080—90145160一170表3-2加压蒸汽灭菌器压力数与蒸汽温度间的关系压力表所示压力全部水蒸汽(无空气)50％空气全部空气磅／英寸2公斤／厘米25101520O.350.71.051.4l108℃115℃121℃126℃94℃105℃112℃118℃72℃90℃100℃109℃在同一温度下，湿热的杀菌效率比干热大，因为微生物细胞蛋白质在湿热情况下，易于凝固，(见表6—2)。同时湿热的穿透力强，当水蒸汽与被灭菌的物品相接触后，便放出汽化潜热，逐步提高被灭菌物品的温度，直至与水蒸汽的温度相等，达到平衡为止,从而提高灭菌效率。手提式高压灭菌锅灭菌的操作步骤如下：(1)在灭菌器内加入一定量的水(有的灭菌器内加水至止水线)。将用防水纸包扎好的灭菌物品如:培养基、无菌水等，放进灭菌器内。(2)接通电源，进行加热。(3)当压力到达5磅／英寸2时，打开放气阀，使锅内的空气和水蒸汽一同排出，直至压力表的压力恢复到零，然后关闭排气阀，继续加热。(4)当压力表上的压力到达15磅／英寸2(即1.05公斤／平方厘米)时，此时灭菌器内的温度达到121℃，维持30分钟不变。对热不稳定的培养基灭菌时，应适当降低压力，延长时间。(5)灭菌时间一到，切断电源，待压力下降至零时，才能打开排气孔，然后打开灭菌器盖，取出物品。如果灭菌后的固体培养基要做成斜面,需趁热放置。还需检查培养基灭菌是否彻底。3．间歇灭菌法：常采用阿诺(Arnold)氏灭菌器和柯赫(Koch)氏灭菌器或蒸笼灭菌，常压条件下，蒸汽温度不超过100度。在没有高压灭菌器设备的情况下或不宜加压灭菌的物品，可采用此法灭菌。做法是：待灭菌物品放在灭菌器或蒸笼里，每天蒸煮一次，每次煮沸一小时，连续三天重复进行。在每两次蒸煮之间，将物品(指培养基)放在37℃恒温条件下培养过夜，这样可以使每次蒸煮后未杀死残留的芽孢萌发成营养体，以使下一次蒸煮时杀灭。4．过滤除菌法：一些不能加热灭菌的液体物质(如维生素、血清)，可以用过滤除菌法，一般用细菌过滤器进行除菌。(教师示范)细菌过滤器中的过滤板常用陶瓷、硅藻土或石棉等做成，过滤板孔眼很小，细菌不能通去。因此，过滤后的液体就除去了细菌。在进行过滤除菌前，整个细菌过滤器和接受液体的器皿，必须包装妥当进行加压蒸汽灭菌后方可使用。5．紫外线灭菌：波长2600一2800A(A=1／10nm)之间的紫外线有很强的杀菌能力，一般紫外灯管能产生2537A的紫外光，杀死力强而稳定，但穿透力弱，一般只适宜物体表面、空气灭菌。例如接种室、培养室、手术室、药厂包装室等空气灭菌。一般30瓦灯管，9立方米空间，距地面2米，每次打开紫外线照射半小时，就使室内空气灭菌。若照射紫外线时，先喷洒石碳酸等化学消毒剂，可增强灭菌效果。在进行微生物接种和分离等操作时，常须用紫外线来杀灭接种室(箱)空气、台面等处的微生物。(参观示范)紫外线虽有较强的杀菌力，但穿透力弱，即使一薄层玻璃或水层就能将大部分紫外线滤除，因此只适用于空气及表面杀菌。表3—4常用化学抑茵剂和杀毒剂类别代表常用浓度作用方式用途及用法醇类乙醇70—75％抑制细菌使蛋白质凝固变性皮肤和器皿消毒对芽孢\孢子无效醛类甲醛37—40％2毫升／米3与蛋白质胺基结合使其变性接中宝、接中箱熏蒸，杀死空气中微生物酚类石炭酸来苏儿5％2—5％破坏细胞膜，蛋白质变性接中室空气及器