硝化细菌的简介及研究思路

1.1问题的提出1.1.1我国水体富营养化状况我国是一个湖泊众多的国家，大于1km2的天然湖泊就有2300多个，湖泊面积为70988km2，约占全国陆地总面积的0.8％。湖泊总蓄水量为7077多亿m3[1]。调查结果表明：2004年七大水系的412个水质监测断面中，I～III类、Ⅳ～Ⅴ类和劣Ⅴ类水质的断面比例分别为41.8％、30.3％和27.9％，七大水系主要污染指标为氨氮、五日生化需氧量、高锰酸盐指数和石油类[3]。2004年监测的27个重点湖库中，II类水质的湖库2个，III类水质的湖库5个，Ⅳ类水质的湖库4个，Ⅴ类水质湖库6个，劣Ⅴ类水质湖库10个。其中，“三湖”（分别为太湖、巢湖和滇池）水质因总氮和总磷浓度高而均为劣Ⅴ类。太湖水质与上年比有所改善，但仍处于中度富营养化状态。滇池的草海属于中度富营养化，外海属重度富营养化。巢湖水质属中度富营养化。对于海洋环境，2004年全海域共发现赤潮96次，较上年减少23次。赤潮累计发生面积266630平方公里，较上年增加83.0％，其中，大面积赤潮集中在东海。目前，水体的富营养化已经成为我国最为突出的环境问题之一。许多大型湖泊，如巢湖、太湖、鄱阳湖、滇池和西湖等，都已经处于富营养或重度富营养化状态。而且一些河流在部分河段也出现了富营养化现象，如黄浦江流域、珠江广州河段等。据统计，我国主要湖泊处于因氮、磷污染而导致富营养化的占统计湖泊的56％[4]。因此，如何治理富营养化的水体，减少其中的营养物质的含量，回复水体的综合功能，已成为当前全球性的环境问题的研究热点[5]。1.1.2富营养化水体的微生物治理针对水体富营养化现象，其水质改善及对策包括三个大的方面：污染源控制对策、水体生态修复对策以及应急除藻对策[6-8]。水体富营养化的关键与核心是生物多样性的破坏，其典型表现就是富营养化水体发生藻类“水华”现象[9]。因此，从保护和恢复生物多样性入手，引入微生物、植物和动物，尤其是关键物种，重建食物链结构，是恢复水体正常的主要手段之一[10-12]。为此经常用到的技术措施包括：以藻控藻，投加细菌微生物[13]、放养鱼类[14]，恢复与构建水生植被[15,16]等。利用微生物种群的新陈代谢活动对富营养化水体中的有机污染物、氨氮和有机氮等进行去除，尤其是氮污染物的去除，主要需要建立硝化－反硝化体系。而在自然界中，原本存在有专门从事硝化－反硝化过程中的微生物种群。但是由于某些微生物种群，如硝化细菌的代时较长，增殖速率非常低。同时，水体的人为活动的破坏。导致了富营养化水体中硝化－反硝化体系的弱化甚至缺失。故针对富营养化水体，可采用向水体中投加复合微生物菌群，从而增强水体的生物自净化能力，达到控制水体富营养化的目的，该技术被称之为“微生物强化技术”。该技术具有费用低、见效快、无污染和方便安全等特点。复合微生物种群主要由光合细菌、硝化细菌等组成，再辅之以反硝化细菌。其中，光合细菌通过自身代谢与藻类竞争性争夺营养物质，并可降解、消除藻类代谢分泌于体外的多种物质，削弱藻类的竞争力。一般的光合细菌都有固氮能力，在厌氧光照条件下固氮能力最强。光合细菌与其他细菌的混合培养，能够提高其他细菌的固氮能力。另外，硝化细菌、反硝化细菌可针对水体中的有机氮和氨氮等进行降解处理。硝化细菌的生长条件是偏碱性的好氧环境。光合细菌在代谢过程中可产生碱性物质，从而为硝化细菌提供了碱性环境。潘涌璋[17]等应用复合微生物培养液和BBL1菌剂，采用投加菌液的方法对富营养化人工景观湖水进行了净化试验，氨氮的去除率大于90％。杨世平[18]等人利用固定化硝化细菌处理养殖废水，24小时后COD去除率为74.9％，氨氮去除率82.5％。周康群[19]等利用投加氨氧化菌、亚硝酸盐氧化菌、芽孢菌和假单胞菌等于广州市西村水厂的水源中，可降解氨氮40％～94.5％。黄晓东[20]等人利用角野以聚丙烯酰胺凝胶为固定化载体，用包埋法固定硝化细菌，并以7.5％的填充率将固定化细胞透入到内循环的流化床中，对按标准活性污泥法运行、含硝化细菌极少的曝气池活性污泥混合液进行连续处理实验，停留时间仅为2小时，就可达到完全硝化。据WagnerM[21]等报道：某化工厂在采用两步生物增强技术，投加降解硝基苯和对硝基苯的菌以及氨氧化菌后，可将出水中的NH4+-N从120mg/L降到20mg/L。1.2硝化细菌的分类及研究现状生物硝化作用（NH3→NO2-→NO3-）在地球氮素循环过程中扮演着极其重要的角色。生物硝化作用主要通过硝化细菌中两个“关键”共生菌群对氮素的迁移和转化作用来实现，这两个共生菌群分别是将氨氮氧化成亚硝酸盐的氨氧化菌（ammonia-oxidizingbacteria，AOB）和将亚硝酸盐氧化成硝酸盐的亚硝酸盐氧化菌（nitrite-oxidizingbacteria，NOB）[22]。1.2.1硝化细菌的分类根据伯杰氏鉴定手册第8版分类，硝化细菌统归于7个属，分别是硝化杆菌属（Nitrobacter）、硝化刺菌属（Nitrospina）、硝化球菌属（Nitrococcus）、亚硝化单胞菌属（Nitrosomonas）、亚硝化螺菌属（Nitrosospira）、亚硝化球菌属（Nitrosococcus）和亚硝化叶菌属（Nitrosolobus），共14种。伯杰氏细菌鉴定手册第9版中除了收录上述7个属外，另增加有2个属，分别是硝化螺菌属（Nitrospira）和亚硝化弧菌属（Nitrosovibrio），总共20种。这些菌种的分布很广，分布于土壤、湖泊及底泥和海洋等环境中[23]。基于16SrRNA基因序列同源性的系统发育分析表明，所有的自养型氨氧化菌系统发育较为单一，他们皆属于变形菌纲（Proteobacteria）γ亚纲和β亚纲（图1所示）[24]，其中属于β亚纲的氨氧化菌又可以分为两个类群：亚硝化单胞菌群（Nitrosomonas）和亚硝化螺菌群（Nirosospira）。其中，亚硝化单胞菌群包括欧洲亚硝化单胞菌属（Nitrosomonaseuropaea）和运动亚硝化球菌（Nitroscoccusmobilis）；亚硝化螺菌属包括所有的属于亚硝化螺菌属（Nitrosospira）、亚硝化弧菌属（Nitrosovibrio）和亚硝化叶菌属（（Nitrosolobus）的菌株，从进化距离上看，这3个属可完全归于1个属。图1-1依据16SrRNA基因序列构建的硝化作用微生物的系统发育[25]Fig.1-1Systematicevolutionofnitrifyingbacteriabasedonthesequencesoftheir16SrRNAThesequencesof16SrDNAwerefromGenBank,andaccessionnumbersfromuptodownwereL35503,L35504,Y14636,Y14644,L35511,L35507,M96400,M96399,M96396,M96397,M96401,M96404,L35510,andM96395与氨氧化菌不同，亚硝酸盐氧化菌的系统发育则要复杂许多，BockE等[26]人的研究结果表明，亚硝酸盐氧化菌的4个属分属于不同的4个系统发育类型（图1）。如，硝化杆菌属（Nitrobacter）属于变形菌纲的γ亚纲，硝化球菌属（Nitrococcus）属于γ亚纲，硝化刺菌属（Nitrospina）属于β亚纲、硝化螺菌属（Nitrospira）属于硝化螺菌门（phylumNitrosira）。以上这些内容充分说明了生物硝化作用中的微生物在进化上系统发育起源的异源性。LipskiA等[27]人研究了亚硝酸盐氧化菌的脂肪酸图谱，结果表明，亚硝酸盐氧化菌中各属所含的脂肪酸存在较大差异，并有各自的特征脂肪酸，所得结果与16SrRNA基因序列相似性分析的结果相吻合[26]。1.2.2硝化细菌的特征1．硝化细菌的自养性硝化细菌绝大部分种类皆为专性化能的自养菌，它们能够利用氨氮或者亚硝酸盐获得合成反应所需的化学能。在有机培养基上几乎不生长（维氏硝化杆菌除外），也不需要外源的生长因素。它们对底物的专一性很强，氨氧化菌以氨氮为底物提供能量，亚硝酸盐氧化菌以亚硝酸盐为底物提供能量。2．生长缓慢，二均分裂[28]硝化细菌是化能自养型菌，其由自身合成糖类，这一过程需要较长的时间。因此，硝化细菌的平均代时一般都在10h以上。大多数种类为无性的二均分裂，只有维氏硝化杆菌为出芽繁殖。3．好氧性硝化细菌皆为好氧生长，O2是最终的电子受体。硝化细菌正常代谢需要溶解氧，溶解氧供给不足可破坏氨氧化菌和亚硝酸盐氧化菌之间的生态平衡。4．形态多样性硝化细菌均为革兰氏阴性菌，无芽孢，无荚膜。虽然生理学上具有共同性，但是，同一生理亚群中的种类，其细胞形态却多种多样，例如，球形、杆形、螺旋形等。其细胞膜大多具有复杂的薄膜状、囊泡状和管状膜内褶结构。DNA中G＋C分子百分含量范围较窄，氨氧化菌的含量略高于亚硝酸盐氧化菌。5．分布硝化细菌对溶解氧、温度、pH等外界环境因素的变化反应较为灵敏，易受外界环境的影响。有些属分布较广，有些则较局限，如硝化球菌和硝化刺菌属的种仅分布在海水中。1.2.3硝化细菌的检测方法早期对于硝化细菌的检测是通过菌体分离、培养，然后形态观察来进行的。但是，由于硝化细菌为化能无机自养型微生物，其生长速率十分缓慢，分离和培养硝化细菌的周期特别长，以硝化杆菌为例，在实验室试验中，其最短的代时也在7h以上。而在自然环境中，绝大部分的硝化细菌由于底物、溶解氧、温度和pH的限制，其代时更会长达几天或者数周。同时，硝化细菌个体小，形态观察十分困难。硝化细菌这种缓慢的生长速率严重的阻碍了对硝化细菌数量的检测，同样也使得对硝化细菌的菌群构成和硝化动力学等方面的研究陷入困境[29-31]。在一个复杂的环境系统中，常规的硝化细菌检测方法为MPN法[32-35]。此方法是建立在统计学基础之上。然而，实施MPN法不仅耗时，而且容易对硝化细菌的数量造成低估，更不能对不同种的硝化细菌进行有效区分[36,37]。根据培养基和培养条件的不同，MPN法仅仅只能对硝化细菌菌群中的一小部分进行计数。可以看出，MPN法已经不能适应硝化细菌的研究。近20年来，随着分子生物学技术的迅速发展，尤其是PCR技术、DNA测序技术以及核酸杂交和多态性技术的广泛应用，使人们从分子水平研究硝化细菌成为可能。通过抗体或16SrRNA的寡聚核苷酸探针，复杂环境中的硝化细菌可以被检测出来。荧光抗体技术可以被直接应用于复杂环境系统中硝化细菌的检测[38-41]。Voytek等（1995）利用嵌套引物两步PCR扩增16SrRNA基因及荧光探针杂交法检测了分离菌种和环境样品中Proteobacteria亚纲的氨氧化菌[42]；Deni等（1995）利用16SrDNA引物特异性扩增了397bpDNA片段，对土壤中的硝化杆菌（Nitrobacter）进行检测和计数[43]。明镇寰等利用PCR对炼化厂生物硝化池曝气池中的硝化细菌进行检测，大大缩短了检测时间（整个过程大约需要6小时），而且劳动量小，灵敏度高[44]。但是，对于识别细胞壁上特异抗原的抗体，其首先需要分离纯化得到靶细胞。尽管如此，这种抗体也仅仅只能识别极少部分的硝化细菌类别。而最近，以关键酶，如氨氧化还原酶和亚硝酸盐氧化还原酶为目标的抗体已被开发成功[45,46]。该技术的优点是，其克服了抗体只能识别细胞壁上位点的问题。这种抗体技术已经成功的应用于环境样品中硝化细菌的检测和关键酶的生理生化研究上[47,48]。另外，环境样品中的硝化细菌可以通过不同的PCR技术得以检测，通常使用16SrRNA[49-50]和关键酶[51,52]序列作为对象。其中，利用此原理的最为参见的方法就是荧光原位杂交（Fluorescenceinsituhybridization，FISH）技术[53-55]。除了上述方法外，Lipski[56]等人研究发现，硝化细菌体内的脂肪酸具有系统发育的多样性，因此，可以作为硝化细菌不同种群的检