厌氧菌培养方法结核杆菌生长现象观察抗酸染色

实验七厌氧菌培养方法、结核杆菌生长现象观察、抗酸染色厌氧菌是自然界中分布广泛、性能独特的一类微生物,专性厌氧菌因其细胞内缺乏超氧化物歧化酶、过氧化氢酶或过氧化物酶,因此无法消除机体在有氧条件下产生的有毒产物——超氧阴离子自由基，故这类微生物极易受氧毒害。专性厌氧微生物即使短暂地把它暴露于空气中,也会引起损伤致死。因此对它们进行分离、培养和研究时,就必须有一套相应的培养分离方法。目的要求1、了解厌氧菌培养常用方法：疱肉培养法、焦性没食子酸法、厌氧罐法、厌氧箱法、厌氧培养袋法等。2、掌握结核杆菌的形态特点，熟悉结核杆菌的培养特性。3、掌握抗酸染色的原理及操作过程。4、了解结核杆菌标本的采集、培养前处理及制片。材料疱肉培养基、厌氧罐、厌氧箱、厌氧培养袋、焦性没食子酸、NaOH、脱脂棉等内容与方法厌氧菌培养方法：包括物理、化学和生物学方法（总之为厌氧菌培养形成一种无氧环境）1.厌氧罐法：厌氧产气袋加入水后会产生氢气和二氧化碳，氢气在厌氧催化剂（冷触酶钯粒钯粒由粉红色变成浅兰色而失效，160℃2h，即可恢复其活力而重复使用）的作用下，与氧结合生成水，可在30分钟内将氧含量降至1%以下。二氧化碳可以促进厌氧菌的生长。罐内放有煮沸去氧的美兰指示剂一管。[每次要新鲜配制，在试管内将亚甲蓝(0.5%亚甲蓝3ml加水至100ml)、6%葡萄糖和氢氧化钠(1/10mol/LNaOH6ml加水至100ml)3种溶液等量混合并煮沸还原至无色，立即将指示剂管放入预先装好培养物的罐内。如果能在孵育的整个过程中维持厌氧条件，则指示剂溶液将无色，否则指示剂则变色。亚甲蓝有氧为蓝色，无氧为无色。]亚甲蓝作为一种氧化还原指示剂。2.焦性没食子酸法：焦性没食子酸+NaOH→焦性没食子橙（黑、褐色）[吸收游离的氧气]。培养皿法用培养皿盖，铺上一薄层灭菌脱脂棉，将1g焦性没食子酸放于其上。用肉膏蛋白陈琼脂培养基倒平板，待凝固稍干燥后，在平板上一半划线接种巴氏芽孢梭菌，下一半划线接种荧光假单胞菌，并在皿底用记号笔作好标记。滴加10％NaOH溶液约0.5ml于焦性没食子酸上，切勿使溶液溢出棉花，立即将已接种的平板覆盖于玻璃板上或培养皿盖上，必须将脱脂棉全部罩住，焦性没食子酸反应物切勿与培养基表面接触，以溶化的石蜡密封皿底与玻璃板或皿盖的接触处。置37℃温箱培养24～48h。3.厌氧培养箱法：由厌氧环境操作箱、恒温培养箱、高度真空传递箱等组成，能任意输入所需气体，准确调节流量，以满足厌氧菌生长需要。4.生物学方法分枝杆菌生物学特性观察材料结核分枝杆菌的培养物方法观察结核分枝杆菌在改良罗氏培养基（含蛋黄、甘油、马铃薯和天门冬酰胺等）上的菌落特点：呈干燥颗粒状，乳白色或米黄色，形似花菜心。结核杆菌12～24h繁殖一代，3～4W形成菌落。抗酸染色法原理分枝杆菌细胞壁含脂质较多,其中主要成分为分枝菌酸,此物具有抗酸性,染色时与石炭酸复红结合牢固,能抵抗酸性乙醇的脱色作用,因此抗酸菌能保持复红的颜色,达到染色目的。材料酒精灯、玻片、结核病人痰液、石碳酸复红、盐酸酒精、碱性美兰等步骤1.取开放性肺结核病人的痰液涂片，自然干燥后，通过火焰固定。2.初染：痰膜上加一小的方形吸水纸，在吸水纸上滴加石炭酸复红染液，在火焰高处徐徐加温至冒蒸气，并维持5分钟（注意切勿让染液沸腾或煮干），当染液蒸发减少时，需再加染液补充。待标本片冷却后水洗。3.用3%盐酸酒精脱色，至无红色染液流下为止（反复2～3次，一般需要1～2min）水洗。4.复染：用碱性美蓝复染1分钟，水洗，吸干，镜检。抗酸杆菌呈红色，背景及非抗酸菌呈蓝色。实验报告：抗酸染色的步骤、抗酸染色结果绘图。问题思考：在痰标本中查出抗酸菌有何意义？为什么对结核杆菌常用抗酸染色而不用革兰染色？