离子交换层析法

离子交换层析法一、原理：离子交换层析法（ionexchangechromatography）,简称IEC,是从复杂的混合物中，分离性质相似大分子的方法之一，依据的原理是物质的酸碱性、极性，也就是所带阴阳离子的不同。电荷不同的物质，对管柱上的离子交换剂有不同的亲和力，改变冲洗液的离子强度和pH值，物质就能依次从层析柱中分离出来。离子交换树脂的交换反应是可逆的，遵循化学平衡的规律，定量的混合物通过管柱时，离子不断被交换，浓度逐渐降低，几乎全部都能被吸附在树脂上；在冲洗的过程中，由于连续添加新的交换溶液，所以会朝正反应方向移动，因而可以把树脂上的离子冲洗下来。如果被纯化的物质是氨基酸类的分子，则分子上的净电荷取决于氨基酸的等电点和溶液的pH值，所以当溶液的pH值较低，氨基酸分子带正电荷，它将结合到强酸性的阳离子交换树脂上；随着通过的缓冲液pH逐渐增加，氨基酸将逐渐失去正电荷，结合力减弱，最后被洗下来。由于不同的氨基酸等电点不同，这些氨基酸将依次被洗出：最先被洗出的是酸性氨基酸，如aparticacid和glutamicacid（在约pH3~4时），随后是中性氨基酸，如glycine和alanine。碱性氨基酸如arginine和lysine在pH值很高的缓冲液中仍带有正电荷，因此这些在约pH值高达10~11时才出现。二、反应机理它大致分为五个步骤：1.离子扩散到树脂表面。2.离子通过树脂扩散到交换位置。3.在交换位置进行离子交换；被交换的分子所带电荷愈多，它与树脂的结合愈紧密，也就愈不容易被其它离子取代。4.被交换的离子扩散到树脂表面。5.冲洗液通过，被交换的离子扩散到外部溶液中三、树脂的选择最常见的离子交换树脂材质是聚苯乙烯-苯二乙烯（polystyrenedivinylbenzene），它是由苯乙烯（styrene）和苯二乙烯（divinylbenzene）聚合产生的三维网状结构，举例来说，Dow化学公司所生产的树脂Dowex50×8，表示含8%苯二乙烯。具体的，根据交换树脂的性能，树脂可分为阳离子与阴离子交换树脂：1.阳离子交换树脂分为强酸型、中强酸型和弱酸型三类，强酸型树脂含有－R－SO3H，中强酸型树脂含有－PO3H2、－PO2H2或－O－PO2H2，弱酸型树脂含有－COOH或－OH。阳离子交换树脂进行的反应如下：2.阴离子交换树脂分为强碱型、中强碱型和弱碱型三类，含有铵盐，四级铵盐[－N+(CH3)3]为强碱型树脂，三级以下铵盐[－N(CH3)2]、[－NHCH3]、[－NH2]都属弱碱型树脂；同时具有强碱和弱碱型基团的，为中强碱型的树脂。阴离子交换树脂进行的反应如下：3.除了树脂以外，纤维素（cellulose）、葡聚糖凝胶（Sephadexgel）和琼脂糖凝胶（Sepharose）也是常用的离子交换材质，特性是具有亲水性和较大的表面积，对生物活性物质而言，是一个较为温和的环境，同时也是大分子所适用的分离纯化材质。常用的种类如下：四、交换剂的选择若被分离物质带正电荷，例如polymyxin、cytochromeC这些碱性蛋白质，它们在酸性溶液中较稳定，亲和力强，故采用阳离子交换剂；其它像heparin、nucleicacid这类酸性物质，在碱性溶液中较稳定，则使用阴离子交换剂；如果欲分离的物质是两性离子，一般考虑在它稳定的pH范围带有何种电荷，作为交换剂的选择。以胰岛素（insulin）为例，它的等电点为pH5.3，因此在pH5.3（酸性）溶液中，采用阳离子交换剂，在pH5.3的碱性溶液中，使用阴离子交换剂。简言之，已知等电点的物质，在高于等电点的pH条件下，因带有负电荷，应采用阴离子交换，在低于等电点的pH下，则采用阳离子交换。未知等电点的物质，在一定pH条件下进行电泳，向阳极移动较快的物质，在同样条件下可被阴离子交换剂吸附，向阴极移动较快的物质可被阳离子交换剂吸附。五、缓冲液的选择缓冲液酸碱度的选择，决定于被分离物质的等电点、稳定性、溶解度和交换剂离子的pK值。使用阴离子交换纤维时要选用低于pK值的缓冲液，若欲分离的物质属于酸性，则缓冲液的pH值要高于该物的等电点；用阳离子交换纤维时要选用高于pK值的缓冲液，目的物属于碱性物质的话，缓冲液要低于该物等电点的pH值。缓冲液离子以不干扰分离物活性测定、不影响待测物溶解度、不发生沉淀为原则，如使用UV吸收法测样品，那么pyridine或barbital这类会吸收UV的物质就不适用。六、离子交换树脂的前处理离子交换树脂使用前，先以蒸馏水除去其内之杂质，并以NaOH和HCl处理树脂，使其上的官能基完全露出。阴离子交换树脂先以15倍于树脂量的0.5NHCl浸泡30~120分钟，再以水清洗至pH7.0，之后用0.5NNaOH浸泡30~120分钟，同样以水清洗至pH7.0，最后用欲使用的缓冲液浸泡。阳离子交换树脂用15倍于树脂量的0.5NNaOH浸泡30~120分钟，以水清洗至pH7.0，之后用0.5NHCl浸泡30~120分钟，再以水清洗至pH7.0，最后用欲使用的缓冲液浸泡。洗涤好的树脂使用前必须平衡至所需的pH和离子强度。已平衡的交换剂在装柱前还要减压除气泡。为了避免颗粒大小不等的交换剂在自然沉降时分层，要适当加压装柱，同时使柱床压紧，减少死体积，有利于分辨率的提高。柱子装好后再用起始缓冲液淋洗，直至达到充分平衡方可使用。七、加样与洗脱1加样：层析所用的样品应与起始缓冲液有相同的pH和离子强度，所选定的pH值应落在交换剂与被结合物有相反电荷的范围，同时要注意离子强度应低，可用透析、凝胶过滤或稀释法达此目的。样品中的不溶物应在透析后或凝胶过滤前，以离心法除去。为了达到满意的分离效果，上样量要适当，不要超过柱的负荷能力。柱的负荷能力可用交换容量来推算，通常上样量为交换剂交换总量的1％-5％。2洗脱：已结合样品的离子交换前，可通过改变溶液的pH或改变离子强度的方法将结合物洗脱，也可同时改变pH与离子强度。为了使复杂的组份分离完全，往往需要逐步改变pH或离子强度，其中最简单的方法是阶段洗脱法，即分次将不同pH与离子强度的溶液加入，使不同成分逐步洗脱。由于这种洗脱pH与离子强度的变化大，使许多洗脱体积相近的成分同时洗脱，纯度较差，不适宜精细的分离。洗脱时应满足以下要求：①洗脱液体积应足够大，一般要几十倍于床体积，从而使分离的各峰不至于太拥挤。②梯度的上限要足够高，使紧密吸附的物质能被洗脱下来。③梯度不要上升太快，要恰好使移动的区带在快到柱末端时达到解吸状态。目的物的过早解吸，会引起区带扩散；而目的物的过晚解吸会使峰形过宽。八、数据分析洗脱馏份的分析按一定体积（5-10ml/管）收集的洗脱液可逐管进行测定，得到层析图谱。依实验目的的不同，可采用适宜的检测方法（生物活性测定、免疫学测定等）确定图谱中目的物的位置，并回收目的物。九、离子交换剂的再生如离子交换纤维素可用2mol/：NaCl淋洗柱，若有强吸附物则可用0.1mol/LNaOH洗柱；若有脂溶性物质则可用非离子型去污剂洗柱后再生，也可用乙醇洗涤，其顺序为：0.5mol/LNaOH-水-乙醇-水-20％NaOH-水。保存离子交换剂时要加防腐剂。对阴离子交换剂宜用0.002％氯已定（洗必泰），阳离子交换剂可用乙基硫柳汞（0.005％）。有些产品建立用0.02％叠氮钠。十、离子交换层析应用离子交换层析技术已广泛用于各学科领域。在生物化学及临床生化检验中主要用于分离氨基酸、多肽及蛋白质，也可用于分离核酸、核苷酸及其它带电荷的生物分子。