蛋白原核表达与纯化(新生培训)2

MolecularMicrobiology&FoodSafetyLaboratory蛋白的原核表达与纯化策略ZHEJIANGUNIVERSITYChengCY2012-11-10PartⅠ蛋白的原核表达PartⅡ蛋白纯化PartⅠ蛋白的原核表达1原核表达概述2原核表达策略选择3表达结果检测4常见问题与实验例大肠杆菌(Escherichiacoli)最通用的原核表达系统遗传背景清楚，基因工程操作方便，商品化表达载体种类齐全，表达效率高；基本不分泌，易形成包涵体(缺乏正确折叠的蛋白结构)，无蛋白加工等修饰；常见的原核表达载体：pET系列(T7promoter，Novagen公司)；pQE系列(T5promoter，Qiagen公司)；pGEX系列(GST融合表达，GE公司)；pBAD系列(Arabinose诱导型)目的基因扩增目的基因插入表达载体重组基因转化入宿主菌中外源基因的表达外源基因在大肠杆菌中表达流程“基因——载体——菌株——培养”系统名称公司启动子抗性常用标签特点pGEXGEtacAmpGST·Tag可溶性表达，纯化难以控制，谷胱甘肽一步洗脱，得到的蛋白纯度较低,通常需要去掉GST·TagpMalNEBtacAmpMBP·Tag可溶性表达，纯化难以控制，麦芽糖一步洗脱，得到的蛋白纯度较低,通常需要去掉MBP·TagpETMerck(Novagen)T7T7lacAmpKanHis·Tag种类丰富。标签小，无需切割，一般来说，对蛋白活性无影响。纯化及其方便。pEASYTransgenT7lacAmpHis·Tag同pET系统常用原核表达载体系统pET表达载体系统pET系统最初由Studier及其同事构建(StudierandMoffatt,1986)，是有史以来在E.coli中克隆表达重组蛋白的功能最强大的系统；目的基因被克隆到pET质粒上，受噬菌体T7强转录及翻译信号控制；表达有宿主细胞提供的T7RNA聚合酶诱导。T7RNA聚合酶机制十分有效并具有选择性：充分诱导时，几乎所有的细胞资源都用于表达目的蛋白，诱导表达后仅几个小时，目的蛋白通常可以占到细胞总蛋白的50%以上。pET各种表达载体特性T7lac启动子:表达更加严谨T7启动子融合标签•常用于蛋白检测与纯化。•有时也可增加蛋白可溶性、将蛋白运转至特定位置。考虑因素细胞特性蛋白稳定性蛋白酶缺陷型——B型菌株，缺失lon、ompT蛋白酶多种常用表达菌株均为此类，如BL21、Origami、Rosetta等启动子tac启动子需要大肠杆菌自身的RNA聚合酶即可：BL21T7启动子需要能够提供T7RNA聚合酶的细胞：DE3溶源菌抗性细胞不能与载体带有相同的抗性：pET-28a+OrigamiB(DE3)No！pET-21b+OrigamiB(DE3)Yes！严谨调控BL21(DE3)pLysS/BL21(DE3)pLysE稀有密码子Rosetta系列溶解性Origami系列：Origami，OrigamiB和Rosetta-gami稀有密码子：不同生物使用密码子存在偏爱性。某种或某几种tRNA的缺乏，会导致外源目的基因的mRNA无法正常在E.coli里表达，是为“稀有”密码子。表达菌株的选择表达条件的优化常用表达条件的优化•培养基组分：葡萄糖会抑制cAMP形成，进而抑制表达，严谨调控，无其他严谨调控手段（pLysS）且毒基因时，至关重要•温度：影响表达速率、蛋白可溶性与活性•IPTG：浓度影响表达速率、蛋白可溶性与活性•其他因素：培养基体积与通气37℃摇床培养到OD600=0.4-0.1（建议OD600为0.6）约3-4小时可达到；从中取出一些样品作为未诱导对照，在剩下的样品中加入IPTG至终浓度0.4（T7启动子）或1mM（T7lac启动子），继续培养3-4小时；菌体5000g，4℃离心。如果需要，收集上清进行进一步分析；重悬细胞于1/10体积预冷的20mMTris-HCl或50mMPBS（pH8.0）中离心；除去上清，菌体保存于-70℃冰箱或继续纯化。常规的诱导条件表达策略的选择实验目的表达策略活性分析可溶表达制备抗原包涵体高纯度融合标签结构研究天然蛋白…………根据实验目的选择表达策略1.选择表达载体2.选择表达菌3.优化表达条件选择表达载体系统名称公司启动子抗性常用标签特点pGEXGE(Pharmacia)tacAmpGST·Tag可溶性表达，纯化难以控制，谷胱甘肽一步洗脱，得到的蛋白纯度较低,通常需要去掉GST·TagpMalNEBtacAmpMBP·Tag可溶性表达，纯化难以控制，麦芽糖一步洗脱，得到的蛋白纯度较低,通常需要去掉MBP·TagpETMerck(Novagen)T7T7lacAmpKanHis·Tag种类丰富。标签小，无需切割，一般来说，对蛋白活性无影响。纯化及其方便。pEASYTransgenT7lacAmpHis·Tag同pET系统选择表达菌株菌株适合启动子特性BL21tac、trc……(pGEX、pMal)适用于非T7启动子的表达系统BL21(DE3)T7/T7lac(pET，pEASY)适用于T7、T7lac的表达系统，适用于非毒基因的表达BL21(DE3)pLysST7/T7lac(pET，pEASY)质粒pLysS含有表达T7溶菌酶的基因，可结合T7RNA聚合酶，降低本底表达水平。适用于严谨调控毒基因的表达Rosetta(DE3)Transetta(DE3)T7/T7lac(pET，pEASY)补充6种稀有密码子对应的tRNA，提高外源基因，特别是真核基因在原核系统中的表达水平OrigamiB(DE3)TransB(DE3)T7/T7lac(pET，pEASY)具有thioredoxinreductase/glutathionereductase双突变，有助于形成更多的二硫键，增加蛋白的可溶性。毒基因：基因表达产物——即目的蛋白，影响宿主生长（“毒性”）BL21(DE3)pLysS、BL21(DE3)pLysE利用T7溶菌酶的严谨调控机制表达产物的检测溶解性信号肽活性免疫原性产量纯化难度胞内表达可溶/包涵体不需要有/无有最高≤50%蛋白种类多，需裂解菌体，复杂周质表达多为可溶需要有有较少≤4%蛋白种类少，需渗透压休克，相对容易胞外分泌完全可溶需要有有变化较大纯化简单。但机理不详，成功先例少表面展示融合膜蛋白/嵌合于膜上需要-有-适用于疫苗开发、抗体制备，前景广阔。表达定位表达产物定位菌液离心菌体细胞总蛋白培养基组分菌体悬菌，裂解，离心胞质可溶组分沉淀8M尿素或者6M盐酸胍溶解，离心胞质不溶组分沉淀悬菌，渗透压休克细胞周质组分SDS-PAGE沉淀上清全菌未诱导1.表达菌株选择：（pET系统）常规表达菌株：BL21表达毒性蛋白：BL21pLys适合表达真核基因：Rosseta（BL21衍生菌，补充大肠杆菌缺少的6种稀有密码子）2.诱导表达pET系统采用T7启动子，诱导剂：IPTG诱导要素：IPTG浓度、诱导温度、诱导时间设置阴性对照：未加IPTG诱导3.SDS-PAGE、WB检测，确定目的蛋白未诱导、诱导后的全菌、诱导后上清、诱导后沉淀无表达或表达量低蛋白不可溶蛋白纯化障碍常见问题与实验例无表达或表达量低•载体-菌株搭配不当•载体构建错误，氨基酸序列发生移码突变等等载体启动子菌株pGEXtacBL21pMaltacBL21pETT7/T7lacBL21(DE3)BL21(DE3)pLysSRosetta(DE3)OrigamiB(DE3)稀有密码子(表达真核基因）•影响：翻译终止，移码突变，氨基酸序列错误，表达量低或无表达•应对：修饰密码子在宿主中补充稀有密码子的tRNARosetta系列菌株（Novagen公司）Rosetta中补充了：无表达或表达量低AUAAGGAGACUACCCGGA1-7:Rosetta(DE3)同时进行了密码子修饰8:BL21(DE3)9:空对照M123456789优化诱导条件，增加蛋白溶解性在E.coli中表达的重组蛋白经常以不溶的、无活性蛋白聚集体的形式表达，被称作包涵体。即使在形成包涵体时，还是有一部分目的蛋白是溶解的。由于pET系统的高表达水平，即使有大量的目的蛋白聚集形成包涵体，也会有相当多的可溶性目的蛋白存在。在通常情况下，降低蛋白合成速率，如降低诱导培养温度及在基本培养基中生长都会使目的蛋白的可溶性增加。诱导和培养条件：37℃（包涵体），30℃，低温(15-20℃)诱导过夜，IPTG浓度，诱导后的培养条件；促进正确折叠：融合催化二硫键形成酶的标签(DsbA)，选择促二硫键形成的质粒和细胞（Origami系列菌株）细胞周质定位：选择带有信号肽的载体（pET12/20/22）融合表达：融合溶解性高的标签（Trx，GST，MBP）宿主菌：尝试可表达真核蛋白的Rosseta菌株裂解缓冲液：普通的Bindingbuffer中一些疏水或膜结构蛋白会是不溶的，但如果加入非离子去污剂就会变成可溶。蛋白的可溶性蛋白的可溶性蛋白质正确折叠，形成有活性、有功能的天然构象的程度。定位：可溶蛋白定位在胞质、细胞周质或者胞外（培养基）包涵体主要定位在胞质和细胞周质；特点：可溶蛋白具有正确折叠的天然构象且具备生物活性；包涵体：高浓度，高纯度，无活性，具免疫原性，不易水解。123Lane1：37℃Lane2：30℃Lane3：25℃12pETpGEXPartⅡ蛋白纯化蛋白纯化方法--亲和层析--凝胶过滤--离子交换层析亲和层析：通过生物分子之间特异性的相互作用来分离物质的方法。特异性：配体—受体抗原—抗体底物—酶可逆性：改变条件可以使结合解除金属螯合层析——6×His·Tag纯化•基本原理与特点•常用纯化流程•常见问题与技巧基本原理与特点•利用固相化的金属离子介质（如Cu2+，Zn2+，Ni2+，Co2+，Fe3+）进行的亲和层析技术，欲分离的蛋白质与金属离子形成共配位复合物而结合，再通过降低pH、加入竞争物(如咪唑）洗脱，从而对蛋白质加以分离。•Ni-Beads基质：琼脂糖凝胶侧链：NTA、IDA配基：Ni2+常见的纯化标签标签纯化用的填料或配基洗脱方法多聚组氨酸（6*His）螯合镍、铜、钴离子的填料咪唑或降低pH谷胱甘肽硫转酶（GST）键合谷胱甘肽的亲和填料10-20mM还原谷胱甘肽多聚精氨酸（Poly-Arg）SP琼脂糖凝胶高盐多聚半胱氨酸（Poly-Cys）活化巯基琼脂糖凝胶DTT多聚苯丙氨酸（Poly-Phe）苯基琼脂糖凝胶乙二醇Ni2+与组氨酸形成配位键Ni-NTANi-IDA金属螯合层析法（Metalchelatechromatography）Ni固相载体HisHisHisProteinimidazoleelution价格低廉，适用范围广常用纯化流程•样品处理•装柱，平衡•上样•洗涤与洗脱•柱子回收M123456M：Proteinmarker1：空载体对照2：包涵体3：纯化前可溶性总蛋白4：上柱结合后样品5：50mM咪唑洗脱样品6：400mM咪唑洗脱样品蛋白纯化例子：蛋白不结合常见问题与技巧•无标签——构建有误、提前终止（C端）、二级翻译起始（N端）测序，重新构建•标签未暴露——变性不充分，天然蛋白折叠，应充分变性•结合条件不合适——螯合剂、还原剂、咪唑、pH值……螯合剂EDTA≤0.1mM（忌用）还原剂DTT≤1mM（不推荐）β-ME≤20mM（慎用）咪唑≤20mM（因蛋白而异）•洗脱条件不合适——咪唑浓度、pH值，应梯度洗脱•非特异性结合上调初始咪唑浓度β-ME非离子型去垢剂、甘油、NaCl……•蛋白不完整——蛋白降解、提前终止（N端）、二级翻译起始（C端）低温，蛋白酶抑制剂重新构建•填料过多蛋白杂带多M123456789M：Proteinmarker1：样品裂解液2-9：等体积梯度洗脱蛋白纯化例子：•洗脱条件不合适——咪唑浓度、pH值增加洗脱强度•蛋白结合能力强上调初始咪唑浓度•蛋白浓度低WesternBlot优化表达•蛋白未结合或被提前洗涤电泳检查全部