大鼠心肌细胞原代培养

实验二大鼠CM的体外分离、培养及鉴定1、材料与方法1.1材料1.1.1实验动物新生3天清洁级Wistar大鼠乳鼠（中国医学科学院放射医学研究所实验动物中心，动物许可证号：scxk2005-0001）。1.1.2主要仪器与试剂5％CO2恒温培养箱（modelTC2323CO2incubator）；倒置相差显微镜（XD-10198010）；PH计（mettlertoledo320-s）；立式自动电热压力蒸汽灭菌器（LDZX-40BI），上海申安医疗器械厂；SW-CJ-2FD型单人双面净化工作台；微量移液枪（法国Gilson）；血球记数板（上海市沪江医疗器材经营部）；HH-6数显恒温水浴锅；离心机（LDZ5-2）；75cm2培养瓶、50ml离心管（美国corning公司）；无菌手术器械；磁力搅拌器；电子天平板（BS1101S德国）；一次性滤器（22μm,GILSON）；DMEM/F12培养基(美国GIBCO)；特级胎牛血清（FBS，Hyclone）；青、链霉素（Hyclone）；D-Hank’s液（NaCl、KCl、Na2HPO4、KH2PO4、NaOH、NaHCO3，苯酚红,南京化学试剂厂）；心肌肌钙蛋白T(Santacruz);FITC连接的兔抗山羊IgG(Santacruz);Ⅱ型胶原酶、胰蛋白酶(Sigma)；Triton-X-100(AMRESCO);BrdU(solarbio)。1.2方法于无菌操作下开胸取出心脏，仔细去除心脏相连大血管和心房组织（留心尖部），于4℃的D-Hank’S液中漂洗3～4次，以去除残存血液，眼科剪将心尖部组织剪成1mm3碎块后，加入4ml的0.0625%胰蛋白酶液，于37℃恒温水浴箱中消化3min，然后弃上清。于剩余沉淀中加入混合消化液5ml（0.0625％胰蛋白酶+0.1％Ⅱ型胶原酶），置37℃水浴消化8～10min，其间振荡2～3次，静置后将上清液移入离心管中，加含10％胎牛血清预冷的DMEM/F12培养液终止消化。随后用上述方法反复消化7～8次至组织块基本消化完毕。收集各次上清液并终止消化后，200目的尼龙网筛过滤去除残留组织块，以1000r/min速度离心8min，将所得的细胞与培养液混悬后，采用差速贴壁分离法去除心肌成纤维细胞每次2h，将未贴壁的心肌细胞悬液吸出，调整细胞密度接种于培养板中。培养前3d加入0.1mmol/LBrdU抑制成纤维细胞生长。48h首次换液，以后根据情况2～3d换液。1.3CM的鉴定弃除培养基，PBs平衡盐缓冲液漂洗3次，以．20℃预冷的4%多聚甲醛固定30min，PBs平衡盐缓冲液漂洗3次后,O．5％tritonx-100穿孔15min。lO％正常兔血清(以PBS平衡盐缓冲液稀释)封闭30min后，分别加入抗肌钙蛋白抗体T(cTnT)(分别以PBS平衡盐缓冲液1：100稀释)4℃过夜，再兔抗羊FITC-IgG室温孵育2小时，每个步骤间均以PBs平衡盐缓冲液漂洗3次，每10min，甘油封片，荧光显微镜激发照相。2．结果2.1心肌细胞的形态在倒置相差显微镜下观察，刚分离的心肌细胞呈圆形，培养2h后成纤维细胞基本完全贴壁，而少数心肌细胞8h左右开始贴壁，少数贴壁的单个心肌细胞出现了自发性搏动，搏动的频率、节律各不同。24h后搏动的心肌细胞百分率大约为50％，搏动频率较分散，约30～50次/min。至48h视野下细胞呈梭形，板形，三角形或扁平不规则形，折光度较高，细胞中隐约可见细胞核，搏动的心肌细胞百分率大于90％，搏动频率多集中在50～80次/min，72h后细胞充分铺展，贴壁牢固，少数局部呈均一搏动频率，可达80～100次/min（附图7-8）。2.2CM的鉴定在免疫荧光染色时一抗选用羊抗大鼠心肌特异性肌钙蛋白T的单克隆抗体，二抗选用FITC标记的山羊抗小鼠IgG，心肌细胞中胞浆呈绿色荧光则显示心肌肌钙蛋白T在胞浆中的表达（附图9）。3小结本研究通过用改良的新生小鼠心肌细胞培养方法，心肌细胞存活率高，心肌细胞和非心肌细胞分离较彻底，细胞贴壁快、搏动早、纯度高，且操作简便，重复性好，是一种较为理想的心肌细胞原代培养方法，可以满足心血管疾病发生、发展机理及心血管药物和心脏组织工程学的研究及多种生理生化实验的要求.