微生物限度检验操作规程

******有限公司质量管理标准文件共3页第1页文件名称微生物限度检验操作规程文件编号编制人编制日期修订人修订日期审核人审核日期批准人批准日期版本号制作份数生效日期颁发部门分发部门1.目的规范菌落总数检验操作，确保检验数据真实有效。2.适用范围适用于本公司菌落总数检验操作规程。4.依据检验规程参照《GB4789.2-2016食品安全国家标准食品微生物学检验菌落总数测定》。4.内容4.1菌落总数定义：食品检样经过处理，在一定条件下（如培养基、培养温度、和培养时间等）培养后，所得每g（ml）检样中形成的微生物菌落总数。4.2仪器与材料：除微生物实验室常用的灭菌及培养设备外，其他设备和材料如下4.2.1恒温培养箱：36℃±1℃4.2.2冰箱：2℃-5℃，4.2.3恒温水浴锅：46℃±1℃，4.2.4天平：感量为0.1g，4.2.5均质器4.2.6无菌吸管：1ml（具有0.01ml刻度）、10ml（具有0.1ml刻度）或微量移液器及吸头。4.2.7无菌锥形瓶:容量瓶250ml、500ml4.2.8无菌培养皿：直径90mm4.2.9pH计或pH比色管或精密pH试纸4.2.10放大镜或菌落计数器微生物限度检验操作规程共3页第2页4.3培养基和试剂4.3.1平板计数琼脂培养基4.3.2虎红培养基4.3.3硫乙醇酸盐流体培养基4.4操作步骤：4.4.1样品稀释：4.4.1.1（1）半固体、固体样液制作：称取25g样品置盛有225ml0.85%的无菌生理盐水内，8000r/min-10000r/min均质1min-2min，或放入盛有0.85%的无菌生理盐水的无菌均质袋中，用拍击式均质器拍打1min-2min，制成1:10的样品。（2）液体样品，以无菌吸管吸取25ml样品置盛有225ml0.85%的无菌生理盐水的无菌锥形瓶（瓶内预置适当数量的无菌玻璃珠）或其他无菌容器中，充分振摇或置于机械振荡器中振摇，充分混匀，制成1:10的样品匀液。4.4.1.2用1mL无菌吸管或微量移液器吸取1：10样品匀液1mL，沿管壁缓慢注于盛有9mL稀释液的无菌试管中（注意吸管或吸头尖端不要触及稀释液面），振摇试管或换用一支无菌吸管反复吹打使其混合均匀，制成1：100的样品匀液。4.4.1.3按4.4.1.2操作程序，制备10倍系列稀释样品匀液。每递增稀释一次，换用一次1mL无菌吸管或吸头。4.4.1.4根据对样品污染状况的估计，选择2个-3个适宜稀释度的样品匀液（液体样品可包括原液）,在进行10倍递增稀释时，每个稀释度分别吸取1mL样品匀液加人两个无菌平皿内。同时分别取1mL稀释液加人两个无菌平皿作空白对照。4.4.1.5及时将15mL-20mL冷却至46℃的平板计数琼脂培养基（可放置于46℃±1℃恒温水浴箱中保温）倾注平皿，并转动平皿使其混合均匀。4.4.2培养：4.4.2.1样品提取：琼脂凝固后，将平板翻转，36℃±1℃培养48h±2h。4.4.2.2如果样品中可能含有在琼脂培养基表面弥漫生长的菌落时，可在凝固后的琼脂表面覆盖一薄层琼脂培养基（约4mL)，凝固后翻转平板，按4.4.1.1条件进行培养。4.4.3菌落计数：4.4.3.1可用肉眼观察，必要时用放大镜或菌落计数器，记录稀释倍数和相应的菌落数量。菌落计数以菌落形成单位（CFU）表示。微生物限度检验操作规程共3页第3页4.4.3.2选取菌落数在30CFU-300CFU之间、无蔓延菌落生长的平板计数菌落总数。低于30CFU的平板记录具体菌落数，大于300CFU的可记录为多不可计。每个稀释度的菌落数应采用两个平板的平均数。4.4.3.3其中一个平板有较大片状菌落生长时，则不宜采用，而应以无片状菌落生长的平板作为该稀释度的菌落数；若片状菌落不到平板的一半，而其余一半中菌落分布又很均匀，即可计算半个平板后乘以2，代表一个平板菌落数。4.4.3.4当平板上出现菌落间无明显界线的链状生长时，则将每条单链作为一个菌落计数。4.5结果计算：4.5.1若只有一个稀释度平板上的菌落数在适宜计数范围内，计算两个平板菌落数的平均值，再将平均值乘以相应稀释倍数，作为每克（或毫升）中菌落总数结果。4.5.2若有两个连续稀释度的平板菌落数在适宜计数范围内时，按下式计算：d)n1.0n(CN21式中：N——样品中菌落数；C——平板（含适宜范围菌落数的平板）菌落数之和；1n——第一稀释度（低稀释倍数）平板个数；2n——第二稀释度（高稀释倍数）平板个数；d——稀释因子（第一稀释度）；示例：稀释度1:100（第一稀释度）1:1000（第二稀释度）菌落数（CFU)232,24433,35d)n1.0n(CN212-10)]21.0(2[3533244232247274.5.3若所有稀释度的平板上菌落数均大于300CFU，则对稀释度最高的平板进行计数，其他平板可记录为多不可计，结果按平均菌落数乘以最高稀释倍数计算。4.5.4所有稀释度的平板菌落数均小于30CFU，则应按稀释度最低的平均菌落数乘以稀微生物限度检验操作规程共3页第4页释倍数计算。4.5.5若所有稀释度（包括液体样品原液）平板均无菌落生长，则以小于1乘以最低稀释倍数计算。4.5.6若所有稀释度的平板菌落数均不在30CFU-300CFU之间，其中一部分小于30CFU或大于300CFU时，则以接近30CFU或300CFU的平均菌落数乘以稀释倍数计算。