外泌体代谢组学研究策略

ContentsPART01代谢研究新热点——外泌体PART02外泌体在医学研究的应用PART03经典案例解析1PART01代谢研究新热点—外泌体2外泌体——国自然热点3截至2019年10月，外泌体相关的国家自然科学基金中标总计已达2.13亿元，较2018年1.69亿元增长26%，2018较2017年1.23亿元增长37%。外泌体——基因组学4外泌体——蛋白组学5外泌体——代谢组学6外泌体研究价值7在临床和治疗方面展现出了其前景的研究价值运载内源性的脂质、核酸、蛋白质、miRNA等信息物质参与机体免疫应答、细胞迁移、肿瘤侵袭、抗原提呈等细胞间通讯、疾病诊断和预后循环生物标志物的重要载体外泌体发展历程8近30年的发展历史，从无到有，由冷到热什么是外泌体外泌体(Exosome)是由细胞分泌而来的微小囊泡，天然存在于血液、尿液、唾液、母乳和细胞培养基等生物体液中，包括肿瘤细胞在内几乎所有类型的细胞（免疫细胞、神经细胞、干细胞)，都可以产生并释放exosome。9什么是外泌体10“小船过河”靶细胞A靶细胞B正常细胞和病理状态的细胞都可以分泌外泌体。每个组织部位的外泌体不同，靶向结合受体也不同。病毒“打劫”外泌体结构11目前研究发现外泌体中富含核酸、蛋白、胆固醇等。可用于基因水平、蛋白水平、代谢水平的研究，成为疾病诊断和医疗的强有力工具。细胞外囊泡外泌体：直径40-100nm，内吞微囊泡：直径100-1000nm，出芽凋亡小体：直径1050-2000nm，凋亡外泌体作用方式12诱导胆固醇堆积外泌体与抗原提呈细胞识别的主要途径介导树突状细胞摄取外泌体近距离：直接与靶细胞的细胞膜融合，非选择性地释放信息物质。外泌体作用方式13作用方式1）直接与靶细胞的细胞膜融合。2）通过内吞作用被靶细胞摄取。3）识别细胞表面的特异性受体。外泌体主要功能14细胞间通信、疾病的传播及组织修复1）将膜蛋白或其内容物转移至受体细胞；2）直接与受体细胞膜融合；3）跨膜蛋白直接作用于受体细胞膜表面的信号分子。4）可以通过介导促炎症反应来促进免疫反应；5）肿瘤细胞分泌的外泌体促进癌症的侵袭和转移，加快血管生成，抑制免疫反应，增强肿瘤的耐药性。外泌体与疾病15●外泌体与肿瘤●外泌体与干细胞●外泌体与心血管疾病●外泌体与免疫疾病●外泌体与神经疾病PART02外泌体在医学研究的应用16外泌体应用方向17一、寻找疾病诊断和预后的分子标志物。外泌体应用方向二、揭示疾病发病机制，从微环境角度解释细胞之间通讯促进疾病发生的原因。三、外泌体作为药物载体，实现靶向给药。外泌体&肺癌早诊18外泌体脂质用于分类早期和晚期非小细胞肺癌研究背景：早期肺癌患者手术切除肿瘤的预后最好，但是在进展为晚期疾病之前，该疾病通常是无症状的，并且尚无有效的基于血液的筛查方法可用于在高危人群中早期发现肺癌。19健康（n=39）、肺癌早期（n=44）、肺癌晚期（n=47）LC-MS检测Biomarker健康VS非小细胞肺癌早期外泌体&肺癌早诊16种脂质外泌体&癌症（机制）20重新编程代谢机制：1）抑制线粒体氧化磷酸化，从而增加癌细胞的糖酵解和谷氨酰胺依赖性还原羧化；2）13C标记的同位素标记，外泌体以类似于大胞饮作用的机制向营养缺乏的癌细胞提供氨基酸，脂质和TCA循环中间体等。成纤维细胞葡聚糖谷氨酰胺外泌体&免疫21抑制免疫：有研究证明病毒利用外泌体在宿主靶细胞之间自由穿梭和准确定位的特点，“劫持”外泌体，将病毒致病相关蛋白、基因组甚至毒粒，转运到全身各处。促进免疫：外泌体携带功能性抗原肽复合物介导抗病毒免疫，从而有效降低宿主对感染的易感性。外泌体研究流程22“天然纳米粒子”实验取材23外泌体取样指南241）细胞培养上清：优势：不会受到样本量的限制。注意：一不能添加含有外泌体的FBS；二是细胞一般培养24-48h后即可分离外泌体；三是注意细胞不允许有污染、细胞死亡率要控制在5%之内。2）血清/血浆：尽量在采血30min内处理样本，分理出血浆和血清，因血液收集在收集管中时，血细胞和血小板还会分泌外泌体。3）尿液：要注意选取中间段的尿液，确保尿液的新鲜度，并注意避免细菌污染。PART03经典案例解析25案例分享126代谢组学可识别胰腺癌的血清和外泌体代谢标志物样本：血清外泌体仪器：LC-MS研究思路27疾病VS对照LC-DDA-MS的非靶向脂质组BiomarkerLC-MRM-MS的靶向脂质定量LysoPC22：0，PC（P-14：0/22：2）和PE（16：0/18：1）与肿瘤分期、肿瘤直径等相关；PE（16：0/18：1）与患者生存率相关。270种脂质61种脂质1.实验分组28胰腺癌患者的外周血（PB）胰腺癌患者的癌旁血（PCB）和健康人的血液（C）2.外泌体分离和鉴定29a.外泌体通过扫描电子显微镜检查。b.Western印迹通过抗CD63验证了外泌体（微管蛋白用作内部对照）。3.非靶向脂质组学分析（DDA‑MS）30PB组和C组之间脂质变化趋势的热图（酰基肉碱，神经酰胺等）PCA得分图（四个组）4.靶向脂质定量（MRM‑MS）31PB组和C组之间血清外体脂质的MRM定量结果5.外泌体脂质与临床特征之间的关联32（LysoPC22：0）与肿瘤分期，CA19-9，CA242，肿瘤直径和淋巴细胞计数有关；[Plasmenyl-PC36：0;PC（P-14：0/22：2）]与肿瘤分期，CA19-9，CA242，CEA和淋巴细胞计数有关；[PE34：1;PE（16：0/18：1）]唯一一个与患者总体生存率相关的脂质。胰腺癌患者生存曲线（P=0.0131）肝细胞模型分泌的细胞外囊泡的代谢物组成和机械特性的差异案例分享233日期:2019年IF:11仪器平台：UHPLC-MS研究思路34小鼠肝细胞祖细胞系MLP29（CM）细胞外泌体（EM）原代大鼠肝细胞RHs（CR）细胞外泌体（ER）靶向UPLC-MS检测比较了细胞和外泌体以及两种细胞模型的代谢状况；使用原子力显微镜研究了脂质组成的差异伴随的机械性能差异1.脂质分析35302种代谢物的主成分分析（PCA）MLP29细胞（CM）和EV（EM）RH细胞（CR）和EV（ER）两两比较，细胞之间的差异要大于细胞与其对应的外泌体间差异。1.脂质分析36氨基酸组和每个脂质家族的相关矩阵分析氨基酸胆固醇酯神经酰胺和单己基神经酰胺甘油二酸酯甘油三酸酯脂肪酸2.细胞和外泌体中脂质分布37两种外泌体中脂质的组成分布甘油三酸酯二酰基甘油磷酸胆碱两种细胞中脂质的组成分布2.细胞和外泌体中脂质分布38两种细胞模型中脂质的组成分布3.脂质比较39条形代表EV的百分比平均值与其亲代细胞的百分比平均值之比的对数的log2（n=4，生物学重复）。MLP29细胞相关RH细胞相关上调下调上调下调4.研究结论401）外泌体EV的脂质组成主要由亲代细胞组成决定；2）源自MLP29和RH的外泌体在神经酰胺、甘油磷脂、鞘磷脂和甘油三酸酯的百分比组成中显示出负相关；3）由MLP29分泌的EV富含不同种类的鞘氨醇和神经酰胺，而在RH分泌的EV中代表性不足；不同来源的外泌体带有与其亲代细胞组成相关的特征性脂质组成。代谢组检测差异代谢物/基因kegg通路注释相关调控基因和酶基因敲除/过表达（体内/体外）酶抑制剂干预（体内/体外）代谢物干预细胞代谢物干预动物模型体内体外验证代谢物的功能体内/体外验证相关调控基因和酶的功能筛选关键差异代谢物信号通路研究PPAR、MAPK、NF-kB等代谢组学的研究思路41谢谢大家的观看42