生化基础知识介绍

生化基础知识介绍主要内容：生化仪发展分析方法介绍几个名词临床意义生化分析仪的发展史：1957年Technicon公司(AutoAnalyzer)，单通道连续流动式，模仿手工。60年代后随电子计算机技术迅速发展。生化自动分析在中国的发展分期分期年代主要特征认识时期1972-1980引进了三台连续流动式生化分析仪，开始研制生化分析仪从认识到应用─自动化的最初阶段1980-19841、引进半自动、全自动生化分析仪约8种型号共几十套。2、第一个中外（美）合作实验室建立，引进一批自动化仪器和配套Kits，开展了室内质控。3、开始研制KIT。4、开展了室间质量调查→EQA。迅速发展时期1984-19901、自动分析仪被广泛认识，自动化程度高，质量好的仪器进入中国，半自动推广较快，型号达20多种近2000套。2、与自动分析仪配套的KIT商品化被广泛接受，酶法分析有较大推广。KIT已从研究步入工业生产。3、出现第二个中外（日）合作自动化程度较高的实验室。自动化分析仪质量越来越高，高速度智能化1990-19961、全自动推广。与国际差距缩小。2、Kits国产和中外合作生产的已占有优势，先进的方法学得到更大普及，13种落后方法被法令淘汰。3、少数大医院开始建立初级的LIS。向可靠而高效的方向发展，TAL在中国开始出现1996-1、LIS应用增多。2、分析前自动化系统引进。3、初级TAL出现。4、IQC，EQA在全国普遍有效开展。远程EQA系统启用。分期年代主要特征全自动生化分析仪临床应用规范化2001年以来1.与国外同步，国产化。2.流水线逐渐推广普及。3.2004年发布《自动生化分析仪应用规范》。4.准确性溯源和检测系统的概念增强。生化仪的分类☆按反应装置结构：连续流动式、离心式和分立式。☆按同时检测项目与否：单通道、多通道。☆按仪器的自动化程度：全自动、半自动。☆按仪器复杂程度：小型、中型和大型。（一）连续流动式分析仪特点：同一管道中进行一个接一个速度慢(二)离心式生化分析仪特点：圆盘内,离心力混合，高速旋转中比色。（三）、分立式分析仪特点：在不同反应杯中进行，不同的加样器自动加样，依次检测可有多个加样臂，速度快。10前分光和后分光方式光栅分光有前分光和后分光两种方式，光源首先经过单色器分光，然后透射到比色溶液的方式为前分光。目前以后分光方式为多见，其优点是单色器中没有转动部分，双波长在同一时刻检测，因而提高了检测的精度和速度。11光源先透过比色杯中的反应液再照射到光栅上，经色散后所有固定单色光同时通过各自的光纤传输到对应的检测器，微处理器按该分析项目的分析参数，后分光方式选择其中一个或两个波长（双波长方式）的吸光度值，用于分析结果的计算。12分析方法分类（一）终点法（endassay）被测物质在反应过程中完全被转变为产物，到达反应终点，根据终点吸光度的大小求出被测物浓度，称为终点法。该法称为平衡法更为恰当。从时间-吸光度曲线来看，到达反应终点或平衡点时，吸光度将不再变化。终点法参数设置简单，反应时间一般较长，精密度较好。13终点时间的确定①根据时间-吸光度曲线来确定，②根据被测物反应终点，结合干扰物的反应情况来确定。14一点终点法（onepointendassay）在反应到达终点，即在时间-吸光度曲线上吸光度不再改变时选择一个终点吸光度值，用于计算结果。结果计算公式：待测物浓度CU=（待测吸光度AU－试剂空白吸光度AB）×KK为校准系数15一点终点法反应曲线A单试剂一点终点法B双试剂一点终点法16两点终点法（twopointendassay）在被测物反应或指示反应尚未开始时，选择第一个吸光度，在反应到达终点或平衡时选择第二个吸光度，此两点吸光度之差用于计算结果。计算公式为：CU=（待测吸光度A2－待测吸光度A1）×K。17两点终点法反应曲线A单试剂两点终点法B双试剂两点终点法18该法能有效地消除溶血(hemolysis)、黄疸（icterus）和脂浊（lipo-turbid）等样品本身光吸收造成的干扰。血红蛋白、胆红素和脂浊的光吸收曲线19（二）固定时间法（fixed-timeassay）指在时间-吸光度曲线上选择两个测光点，此两点既非反应初始吸光度亦非终点吸光度，这两点的吸光度差值用于结果计算。有时也称此法为两点法。计算公式与两点终点法相同，CU=(A2-A1)×K。20固定时间法反应曲线A单试剂固定时间法B双试剂固定时间法该分析方法有助于解决某些反应的非特异性问题。21连续监测法（continuousmonitoringassay）又称速率法（rateassay），是在测定酶活性或用酶法测定代谢产物时，连续选取时间-吸光度曲线中线性期（各两点间吸光度差值相等）的吸光度值，并以此线性期的单位吸光度变化值（ΔA/min）计算结果。22连续监测法反应曲线A单试剂连续监测法B双试剂连续监测法23酶促反应的线性段δ1及δ5值偏小，而δ2＝δ3＝δ4，故A1点至A4点属线性段24连续监测法的优点可以确定线性期并计算ΔA/min，根据此值再准确地计算酶活性，因而使自动生化分析仪在酶活性测定方面显著地优于手工法。连续监测法也可用于测定呈线性反应的代谢物浓度，一般是某些基于酶法测定的代谢物。酶活性（U/L）＝ΔA/min×理论（或校准）K值。代谢物浓度CU=ΔA/min×校准K值。25理论K值多用于酶活性测定中，因酶活性尚无公认的校准品可用。根据酶活性的国际单位定义得出酶活性的计算公式为：酶活性(U/L)=ΔA/min×将此式中以K来表示，即为理论K值可作为分析参数输入到分析仪中。dSTTVε310dSTTVε31026采用理论K值的前提应当是样品和试剂的加量准确、比色杯光径准确、温度控制精确以及波长准确等。但事实上由于各型分析仪在注射器容积步进电机精度、滤光片带宽等方面的差异，可造成样品和试剂加量以及吸光度检测的偏差，温度的影响有时也非常大。27实际摩尔吸光系数和K值测定由于摩尔吸光系数受比色杯光径、波长等的影响，书本上或试剂厂家提供的理论摩尔吸光系数可能与实际所用分析仪所测的不同，因而有必要获得实际的摩尔吸光系数，然后来计算理论K值。28NADH（NADPH）摩尔吸光系数的测定NADH（NADPH）没有标准纯制品，而且配成溶液后稳定性又较差，不能直接用NADH或NADPH标准液来校正仪器，须通过有NAD+(NADP+)参与的反应途径。29•用已糖激酶(HK)或葡萄糖脱氢酶(GD)方法测定葡萄糖时，葡萄糖的消耗与NADH的生成呈等摩尔关系。葡萄糖有标准纯制品。•根据公式A=εbC，已知比色杯光径b和葡萄糖标准液浓度，测得葡萄糖标准管的吸光度A后便可计算出NADH（NADPH）的摩尔吸光系数ε为A/bC。30测定方法葡萄糖标准液浓度为1Ommo1/L(0.01mol/L)，标准液加入量为3.5μL，酶试剂加入量为335μL，比色杯光径为0.7cm，在340nm测得吸光度为0.465，则实测NADH摩尔吸光系数=＝6424，即在此台分析仪上340nm波长处测得NADH（NADPH）的摩尔吸光系数为6424，而理论上NADH（NADPH）的ε为6220。5.33355.301.07.0465.031校准K值酶活性校准品经校准操作后由分析仪自动计算得出。在进行酶学测定时，如果分析条件的变化如温度、样品试剂加量和吸光度检测偏差可同等程度地影响校准物和待测样品，则使用校准品能进行补偿。一般来说以使用校准K值为好，但必须有两个先决条件：①必须使用配套的试剂；②必须使用配套的高质量的校准品，该校准品应具有溯源性。32（四）透射比浊法抗原与相应的抗体结合形成的免疫复合物，在反应液中具有一定的浊度，可由一般分光光度法进行透射比浊（transmissionturbidimetry）测定，可用于某些蛋白质和药物浓度等的测定。该法须做多点校准，再经非线性回归，求出抗原或抗体的含量。33常用生化检测项目分析方法举例1．终点法检测常用的有总胆红素（氧化法或重氮法）、结合胆红素（氧化法或重氮法）、血清总蛋白（双缩脲法）、血清白蛋白（溴甲酚氯法）、总胆汁酸（酶法）、葡萄糖（葡萄糖氧化酶法）、尿酸（尿酸酶法）、总胆固醇（胆固醇氧化酶法）、甘油三酯（磷酸甘油氧化酶酶法）、高密度脂蛋白胆固醇（直接测定法）、钙（偶氮砷Ⅲ法）、磷（紫外法）、镁（二甲苯胺蓝法）等。342．固定时间法苦味酸法测定肌酐采用此法。353．连续监测法对于酶活性测定一般应选用连续监测法，如丙氨酸氨基转移酶、天冬氨酸氨基转移酶、乳酸脱氢酶、碱性磷酸酶、γ谷氨氨酰基转移酶、淀粉酶和肌酸激酶等。一些代谢物酶法测定的项目如：脲酶偶联法测定尿素等，也可用连续监测法。364．透射比浊法透射比浊法可用于测定产生浊度反应的项目，多数属免疫比浊法，载脂蛋白、免疫球蛋白、补体、抗“O”、类风湿因子，以及血清中的其他蛋白质如前白蛋白、结合珠蛋白、转铁蛋白等均可用此法。37单波长和双波长方式（一）概念采用一个波长检测物质的光吸收强度的方式称为单波长方式。当反应液中含有一种组分，或在混合反应液中待测组分的吸收峰与其它共存物质的吸收波长无重叠时，可以选用。使用一个主波长和一个次波长的称双波长方式。当反应液中存在干扰物的较大吸收、从而影响测定结果的准确性时，采用双波长方式更好。38（二）双波长的作用①消除噪音干扰;②减少杂散光影响;③减少样品本身光吸收的干扰：当样品中存在非化学反应的干扰物如甘油三酯、血红蛋白、胆红素等时，会产生非特异性的光吸收，双波长方式可以部分消除这类光吸收干扰。39（三）次波长的确定方法当被测物的主波长确定之后，根据干扰物吸收光谱特征选择次波长，使干扰物在主、次波长处有尽可能相同的光吸收值，而被测物在主、次波长处的光吸收值应有较大的差异。一般来说，次波长应大于主波长100nm。以主波长与次波长吸光度差来计算结果。40单试剂和双试剂方式反应过程中只加一次试剂称单试剂方式，加两次试剂便为双试剂方式。双试剂方式分析的优点是：①可提高试剂的保存稳定性；②能设置两点终点法；③在某些项目检测时能消除非特异性化学反应干扰。41双试剂方式消除非特异性化学反应干扰举例血清ALT测定时，血清中原有酮酸也可与试剂LDH起反应，使结果偏高。若先加入缺乏α-酮戊二酸的第一试剂，使原有酮酸与LDH反应，之后加入含有α-酮戊二酸的第二试剂，启动ALT酶促反应生成丙酮酸，这些丙酮酸与LDH反应消耗的NAD＋能真正反映ALT活性，从而消除以上副反应的影响。42底物消耗的监测在连续监测法测定酶活性时，如果在监测期内吸光度上升或下降超过其底物耗尽值，则说明该样品酶活性非常高，底物将被耗尽，监测期的吸光度将偏离线性，使测定结果不可靠。此监测对于采用负反应分析酶活性的方法甚为重要。43底物消耗监测44校准分析仪在样品分析之前要对该分析项目进行校准（也称定标），得出一个该项目的校准系数（K）。校准前首先必须在反应程序里设定有关校准的参数，如校准液的代码、位置及浓度值等。执行校准程序，检测得到该校准品的吸光度值，再根据校准浓度计算校准系数（K=校准品浓度/校准品吸光度）。45校准方式有单点校准、两点校准和多点校准单点校准：校准曲线呈直线且通过原点，用单个浓度的校准液即可两点校准：若校准曲线呈直线但不通过原点，则需用两个浓度的校准液做两点校准；多点校准：当校准曲线不呈直线而为真正的曲线时，应做多点校准，并按其线形选择不同的曲线方程进行拟和，如双曲线、抛物线、幂函数、指数函数、对数函数等方程等。46对校准的要求（1）选择合适（配套）的校准品（2）如有可能校准品应溯源到参考方法或参考物质。（3）确定校准的频度。（4）如有下列情况发生时，必须进行校准：①改变试剂的种类或批号；②仪器或者检验系统进行一次大的预防性维护或者更换了重要部件；③质控反映出异常的趋势或偏移，或者超出了实验室规定的接受限。47质控品测定质控是保证检测结果可靠性的一个重要手段，因此每批样品的分析测定均应该有质控样品同时监测。关于分析仪的批测定，是