包涵体蛋白质复性纯化

MarketProportionbyHostCells(biopharmaceuticalproteinsor”Pharmateins”)Yeast:28%E.coli:54%Animalcell:21%E.coliinclusionbodyrouteoccupiesaboutahalf包涵体：在某些生长条件下，基因工程菌能积累某种特殊的生物大分子，它们致密地集聚在细胞内，或被膜包裹或形成无膜裸露结构，这种水不溶性的结构称为包涵体（InclusionBodies，IB）。包涵体的组成及特性一般含有50%以上的重组蛋白，其余为核糖体元件、RNA聚合酶、外膜蛋白等，环状或缺口的质粒DNA，以及脂体、脂多糖等，大小为0.5-1um，难溶与水，只溶于变性剂如尿素、盐酸胍等。包涵体与蛋白种类及表达系统无关，仅为蛋白过量表达的结果。包涵体的形成在重组蛋白的表达过程中缺乏某些蛋白质折叠的辅助因子，或环境不适，无法形成正确的次级键等原因形成的。最大缺点：一级结构正确，高级结构错误。包涵体形成的主要原因1.表达量过高。原因可能是合成速度太快，以至于没有足够的时间进行折叠，二硫键不能完全正确的配对，过多的蛋白间的非特异性结合，蛋白质无法达到足够的溶解度等。2.重组蛋白的氨基酸组成：一般说含硫氨基酸越多越易形成包涵体3.重组蛋白所处的环境：发酵温度高（37-42℃）或胞内pH接近蛋白的等电点时容易形成包涵体。4.重组蛋白是大肠杆菌的异源蛋白，由于缺乏真核生物中翻译后修饰所需酶类，致使中间体大量积累，容易形成包涵体沉淀。采用共表达分子伴侣的方法以增加可溶蛋白的比例。包涵体表达的有利因素Advantages:1.可溶性蛋白在细胞内容易受到蛋白酶的攻击，包涵体表达可以避免蛋白酶对外源蛋白的降解。2.降低了胞内外源蛋白的浓度，有利于表达量的提高。有时甚至可以达到细胞总蛋白含量的30%3.包涵体中杂蛋白含量较低，且只需要简单的低速离心就可以与可溶性蛋白分离，有利于分离纯化。4.包涵体表达的蛋白质没有活性，细胞破碎和以后复性前的纯化步骤，不用考虑蛋白质的失活问题。1.对表达蛋白的胞内修饰过程不了解。2.要求复杂和精确的复性过程3.复性过程的收率往往很低，经常成为放大的瓶颈包涵体表达的不利因素Disadvantages:分离纯化细菌包涵体蛋白质的基本步骤：破碎细胞(Disruptionofcell)↓分离包涵体(Seperationofinclusionbody)↓溶解包涵体(Dissolveinclusionbody)↓蛋白质产物的构象复原等。(Recoveryoftargetproteinconformation)包涵体的复性前准备洗涤：由于脂体及部分破碎的细胞膜及膜蛋白与包涵体粘连在一起，在溶解包涵体之前要先洗涤包涵体，通常用低浓度的变性剂如2M尿素在50mMTrispH7.0-8.5左右、1mMEDTA中洗涤。此外可以用温和去垢剂TritonX-100洗涤去除膜碎片和膜蛋白。包涵体的溶解1.采用高浓度的变性剂，使其形成伸展的肽链。常用的变性剂有尿素（8M）、盐酸胍（GdnHCl6-8M），通过离子间的相互作用，破坏包涵体蛋白间的氢键而增溶蛋白。尿素的增溶效果稍差，异氰硫酸胍（GdnSCN）最强。变性剂的使用浓度和作用时间：一般在偏碱性的环境中如pH8.0-9.0，尿素在碱性环境中不稳定。有些蛋白只能用盐酸胍。增溶时一般室温过夜，但盐酸胍在37度1小时便可以使多数蛋白完全变性溶解。2.去垢剂：如强的阴离子去垢剂SDS，可以破坏蛋白内的疏水键，避免蛋白形成疏水核心，可以增溶几乎所有的蛋白。但由于SDS无法彻底的去除而不允许在制药过程中使用（研究）。3.极端pH：可以破坏蛋白的次级键从而增溶蛋白。如在pH9.0溶解牛生长激素和牛凝乳蛋白酶包涵体。有些蛋白可以溶解在60mMHCl中。这些方法只适合于少部分蛋白的增溶。4.还原剂：由于蛋白间二硫键的存在，在增溶时一般使用还原剂。还原剂的使用浓度一般是50-100mMDTT，也有使用5mM浓度。实际，还原剂的使用浓度与蛋白二硫键的数目无关，而有些没有二硫键的蛋白加不加还原剂无影响。对于目标蛋白没有二硫键某些包涵体的增溶，有时还原剂的使用也是必要的，可能由于含二硫键的杂蛋白影响了包涵体的溶解。含有半胱氨酸的蛋白质，需要加入还原剂巯基乙醇、二硫苏糖醇等。加入金属螯合剂EDTA去除金属离子。(伸展态)U→(中间态)I→(自然态)N↓A（包涵体）从中间体转变为天然态的过程比较缓慢。当溶液中离子强度或变性剂浓度很低，又无其它辅助手段存在时，聚集趋势占主导地位，导致蛋白质的自发复性效率极低。蛋白质折叠的三态模型复性目的复性：通过缓慢去除变性剂（避免折叠中间体重新聚集）使目标蛋白从变性的完全伸展状态（？）恢复到正常的折叠结构，同时去除还原剂使二硫键正常形成。一般在尿素浓度4M左右时复性过程开始，到2M左右时结束。对于盐酸胍而言，可以从4M开始，到1.5M时复性过程已经结束。蛋白质的复性是重组蛋白纯化中最关键和最复杂的问题。蛋白质的性质不同，所处的环境不同，使其复性条件大不相同。任何一个蛋白质都有一个最佳的复性条件，只有选择到了合适的复性缓冲液，使蛋白得以正确折叠，才能使进一步的层析分离得以顺利完成。三、包含体蛋白复性方法几个要求：活性蛋白的回收率高正确的复性的产物易于与错误的折叠蛋白质分离。折叠复性后应得到浓度较高的蛋白质产品复性过程耗时少复性常用方法1.稀释复性：直接加入水或复性缓冲液，缺点是体积增加较大，后续处理困难。稀释蛋白浓度：浓度高则容易形成聚集体（较低的复性收率）。有时需低于0.01mg/mL。脉冲流加复性：分批次加入到缓冲液中，使折叠中间体保持在较低的水平。例：在5-10mg/mL终浓度下，溶菌酶复性收率可达80%以上。2.透析复性：好处是不增加体积，通过逐渐降低外透液浓度来控制变性剂去除速度，速度慢，不适合大规模操作，无法应用到生产规模。3.超滤复性：选择合适载留分子量的膜，允许变性剂通过膜而蛋白质通不过。在生产中较多的使用，规模较大，缺点是不适合样品量较少的情况，且有些蛋白可能在超滤过程中不可逆的变性（蛋白聚集于膜上）。4.色谱复性：辅助手段，兼具分离。4.1凝胶过滤复性：除了蛋白质在胶粒中传质和扩散外，蛋白质与介质之间并没有发生其他作用。该法可以起到一定的抑制凝集作用，并且在凝胶过滤中脲等变性剂脱除得相对较慢，对有些蛋白质的复性有利。4.2吸附型层析复性：离子交换、疏水层析、亲和层析和扩张床层析均属于吸附层析。其基本复性原理是层析柱平衡后，将变性蛋白上样并吸附在凝胶介质上，然后用清洗缓冲液洗掉未吸附的变性剂和杂蛋白，最后用复性缓冲液将吸附的蛋白洗脱下来，在洗脱过程中完成复性。Solid-Phase(orMatrix-assisted)RefoldingIBinE.coliSolubilizedIB(unfolded)AggregateRefoldedBioactivemonomerRefoldingSolution-stateFSolidSupportFunctionalGroupSolid-staterefoldingRemoveDenaturantF5.分子伴侣：主要包括硫氧还蛋白二硫键异构酶、肽酰一辅氨酰顺反异构酶等。分子伴侣和折叠酶等不仅可在细胞内调节蛋白质的折叠和聚集过程的平衡，而且可在体外促进蛋白质的折叠复性。体内复性主要是在工程菌培养过程中同时加入分子伴侣的基因进行共表达；体外复性主要是将基因工程菌中包涵体溶解，再加入分子伴侣帮助折叠。复性过程中的添加剂低分子化合物自身并不能加速蛋白质的折叠，但可能通过破坏错误折叠中间体的稳定性或增加折叠中间体和未折叠分子的可溶性来提高复性产率。可防止不可逆聚集体的出现。盐酸胍、脲、烷基脲以及碳酸酰胺类等，在非变性浓度下是有效的促进剂。In-VitroRefoldingPathwaySSSSUnfoldedAggregateIntermediate(moltenglobular)3DStructure(Bioactive)SSSSCorrectlyFoldedIntramolecularMisfoldingSSSSSSSSSSSSIntermolecularMisfoldingStandardIBRenaturationProcessCellDisruptionRefoldingPost-refoldingpurificationstepIBIsolationIBWashingSolubilizationCentrifugationRemoveCellDebrisDenaturantPartialRemovalofDenaturantCompleteRemovalofDenaturantIBDissolvedRefoldingE.g1:rhGM-CSFfrE.coliinclusionbodiesPhenylSepharoseFFQSepharoseFFSuperdex75PrepGradeHICIEXGFRenaturedrhGM-CSFRemovesbufferconstituents(Guanidine-HCl,Berol185,glutathioneetc)•Purificationfactor:ca2•Recovery:92%ofactivity•Concentrationfactor:ca5Belew,M.etal.(1994)J.Chromatogr.A,679:67-83大肠杆菌包涵体表达(His)6融合蛋白的扩增，纯化和复性E.g2:过程32细胞培养收获细胞细胞破碎离心5-10000g沉淀物冲洗和离心分离包涵体HiTrap™Chelating＋Ni2+纯化和复性溶解包涵体-细胞破碎,冲洗和分离每100ml培养液重新悬浮细胞沉淀物於4ml20mMTris™-HClpH8.0在冰浴情况下，用超声震荡破碎细胞，并在+4ºC下高速离心10分钟重新悬浮细胞沉淀物於2ml含e.g.urea的冲洗缓冲液和再度超声震荡并在+4ºC下高速离心10分钟用冲洗缓冲液冲洗细胞沉淀物332MUREA20mMTrisHCl2%TritonX1000.5MNaCl溶解和准备样品重新悬浮细胞沉淀物於5ml溶解缓冲液(e.g.):20mMTris™-HCl,0.5MNaCl,5mM咪唑,6M盐酸胍,1mM2-巯基乙醇pH834在室温等30-60分钟在+4ºC离心15分钟用0.22µm或0.45µm濾膜过滤准备HiTrap™Chelating柱冲洗5mlH2O加0.5ml0.5MNiSO4冲洗5mlH2O用5-10ml20mMTris™-HCl,5mM咪唑,6M盐酸胍,1mM2-巯基乙醇pH8结合缓冲液洗柱35最多5分钟纯化和复性36稀释样品,用10ml结合缓冲液洗柱，5mM咪唑,6M盐酸胍,pH8.0上样，并以20mM咪唑,6M尿素pH8.0缓冲液洗柱复性线性梯度：~6to0M尿素最少30柱体积流速：0.1ml/min-1ml/min用没有尿素缓冲液冲洗5个柱体积纯化和洗脱线性梯度:20mM-500mM咪唑10-20柱体积用HiTrapDesalting交换缓冲液去除咪唑1.00.750.50.25010203040506065mlManuallyusingasyringe:•Sampleloading•Gua-HClwash•UreawashStartelutionfr.38fr.42fr.46fr.49fr.40Startrefold-ingA280组份分析371:LMW2:样品3-6:盐酸胍冲洗物7,8:尿素冲洗物1:LMW2-6:组份38-427,8:组份48,491.00.750.50.2505101520mlA280kD9467433020.114.412345678kD9467433020.114.412345678Superdex™75HR10/30SDSPAGEPhastGel™Gradient10–15样品稀释前