蛋白质相互作用

蛋白质相互作用：1.本身具有生物学意义：这样的相互作用在生物体中是起什么作用的2.发展技术：利用这样的相互作用创造出一些人为的作用研究蛋白质相互作用的目的是发现并明确其相互作用的生物学意义蛋白质相互作用是一种表象，通过表象分析规律，是研究蛋白质相互作用的核心“种瓜得瓜，种豆得豆”是一种表象，反映了遗传这样一种本质现象可研究对象合适的研究方法研究蛋白质相互作用需要微观和宏观的结合象与象的一部分定量分析是研究蛋白质相互作用的基础Input：10~20mgtotalproteinsIPsample：Immunoprecipitatedfrom1000mgoftotalproteins定量分析是研究蛋白质相互作用的基础Relativeexposurelevel研究蛋白质相互作用的意义1、蛋白质间的相互作用是细胞生命活动的基础。2、基因只是决定蛋白质，而蛋白质才是发挥作用的主体。蛋白质的相互作用是发挥其功能的主要活动。稳定相互作用形成蛋白质复合体（proteincomplex）瞬时相互作用（enzyme-substrate）生物学效应稳定的相互作用与瞬间的相互作用共同构成蛋白质相互作用的内涵。研究蛋白质相互作用是为了研究相应的生物学功能确定研究目标寻找相互作用建立相互作用网络和功能体系•从蛋白质相互作用到生物学功能。运用蛋白质直接相互作用，发现相互作用蛋白质，再分析这些作用的生物学意义。容易犯的错误：研究一大堆的蛋白相互作用，却不知道这些相互作用有什么生物学意义。•从物学功能到蛋白质相互作用。通过改变生物学现象，分析蛋白质间的遗传相互作用，进一步研究相关蛋白质的相互作用。容易犯的错误：找到了平行变化的不相关蛋白质。发现蛋白质相互作用蛋白质-蛋白质直接相互作用遗传功能分析序列与结构比较模拟验证蛋白质相互作用不同方法的交叉验证不同生物体系中验证ProteininteractionAffinity:A+B=ABKd=[A][B]/[AB],Kd:dissociationconstantInteractionKdStreptavidin-biotinbinding10-14MAntibody-antigeninteraction(good)10-8-10-10MAntibody-antigeninteraction(weak)10-6MEnzyme-substrate10-6-10-10M蛋白质-蛋白质直接相互作用蛋白质-蛋白质直接相互作用•Co-immunoprecipitationandantigen-antibodyinteraction（免疫共沉淀和抗原抗体结合）•Affinityinteraction（亲和作用）•Yeasttwo-hybridandphagedisplay（酵母双杂交和噬菌体展示）•SurfacePlasmonResonance•FRET•Proteomicanalysis（蛋白质组学技术）Co-immunoprecipitationandantigen-antibodyinteraction（免疫共沉淀和抗原抗体结合）Westernblot：变性抗原，主要用于检测蛋白质的存在与否。免疫共沉淀：非变性抗原，用于鉴定不同蛋白质间的相互作用。免疫共沉淀：Ab－Pr1－Pr2非特异性结合：Pr1－Ab－Pr2抗体筛库：cDNA表达库，抗体结合表达的蛋白质，从而得到基因。已经被质谱和PCR所淘汰Westernblot1、电转移效率2、PVDF膜的充分浸润3、转移液中有太多的SDS4、膜的损坏5、转移时胶和膜没有完全接触6、抗体的问题7、抗体的浓度太高或太低8、还原性物质的存在9、封闭不充分SDS－PAGEacrylamide的浓度蛋白质上样的量相邻泳道的蛋白质量、离子强度和样品体积转移膜：PVDF膜nitrocellulose膜抗体免疫共沉淀免疫共沉淀：Ab－Pr1－Pr2非特异性结合：Pr1－Ab－Pr2免疫共沉淀123541.抗体很差，2.Westernblot问题3.Loading比例不对4.样品太多5.正确蛋白质-蛋白质直接相互作用•Co-immunoprecipitationandantigen-antibodyinteraction（免疫共沉淀和抗原抗体结合）•Affinityinteraction（亲和作用）•Yeasttwo-hybridandphagedisplay（酵母双杂交和噬菌体展示）•SurfacePlasmonResonance•FRET•Proteomicanalysis（蛋白质组学技术）Affinityinteraction（亲和作用）GSTpulldown：已知蛋白质和GST融合，与细胞或组织的“蛋白质汤”混合，用谷胱甘肽亲和层析分离和已知蛋白质结合的新蛋白质。GSTtag。Biotin－Avidin结合：Biotin标记已知蛋白质，通过Avidin结合biotin标记的蛋白质，从而得到与biotin标记蛋白结合的新蛋白质。优点是biotin－avidin的结合是最牢靠的；缺点是细胞内结合biotin的蛋白质很多。各种不同的tag。许多GSTpulldownGSTFusionProteinPurificationbindingwashelutionGSTpulldownGSTfusionprotein不够纯，用作bait会产生太多的非特异性蛋白质污染。GSTpulldownGSTPulldownbindingwashelutionBiotin－Avidin结合：生物界最稳定的结合之一蛋白质-蛋白质直接相互作用•Co-immunoprecipitationandantigen-antibodyinteraction（免疫共沉淀和抗原抗体结合）•Affinityinteraction（亲和作用）•Yeasttwo-hybridandphagedisplay（酵母双杂交和噬菌体展示）•SurfacePlasmonResonance•FRET•Proteomicanalysis（蛋白质组学技术）Yeasttwo-hybrid（酵母双杂交）•发现新的相互作用蛋白质•鉴定和分析已有的蛋白质间的相互作用•确定蛋白质间相互作用的功能基团lacZUASDBADlacZUASADDBlacZlacZUASDBlacZ发现新的相互作用蛋白质B-Pr基因库lacZUASADlacZDBB-Pr基因库lacZUASADlacZDBB-PrY基因库确定蛋白质间相互作用的功能基团ProteinA1234B-Pr1233白兰白白鉴定和分析已有的蛋白质间的相互作用B-PrA-Pr兰：相互作用白：不相互作用Two-Hybrid的优点：•是酵母细胞内的invivo相互作用。•只需要cDNA，简单。•弱的相互作用也能检测到。Two-Hybrid的缺点：•都是融合蛋白，万一融合出新的相互作用。•酵母的翻译后修饰不尽相同。尤其是蛋白质的调控性修饰。•自身激活报告基因。•都基因库的要求比较高，单向1/3是inframe•蛋白质毒性。•第三者Z插足介导的相互作用。•假阳性。lacZUASlacZDBAutoactivationXADlacZUASlacZYPhagedisplay（噬菌体展示）Phagedisplay（噬菌体展示）Phagedisplay的最大优点是数量大细胞：108~109细菌：1010Phage：1012寻找受体的配体7肽：8x1016蛋白质-蛋白质直接相互作用•Co-immunoprecipitationandantigen-antibodyinteraction（免疫共沉淀和抗原抗体结合）•Affinityinteraction（亲和作用）•Yeasttwo-hybridandphagedisplay（酵母双杂交和噬菌体展示）•SurfacePlasmonResonance•FRET•Proteomicanalysis（蛋白质组学技术）SPRisusedtomonitorinteractionsoccurringinabiospecificsurfaceonametallayerbymeasuringchangesinthesoluteconcentrationatthissurfaceasaresultoftheinteractions.SurfacePlasmonResonanceSPR优点：无标记、实时Label-freedetectionSRPdoesnotrequireanylabelsorreportergroupstodetectbiomolecularinteractions.Itfollowseverystepinamulti-stepanalysisprocedure,incontrasttolabel-basedmethodsthatoftenonlyreportthefinalstep.RealtimemeasurementTheprogressofinteractionsisdisplayeddirectly,asaplotofresponse(whichisdirectlyrelatedtoconcentrationchangesatthesurface)againsttime.Immediatefeedbackonthestatusofaninteractionspeedsupassaydevelopmentandanalysis.Theresultscanbeprocessedfurtheraftertherun,forexampletoextractkineticconstantsfortheinteraction.蛋白质-蛋白质直接相互作用•Co-immunoprecipitationandantigen-antibodyinteraction（免疫共沉淀和抗原抗体结合）•Affinityinteraction（亲和作用）•Yeasttwo-hybridandphagedisplay（酵母双杂交和噬菌体展示）•SurfacePlasmonResonance•FRET•Proteomicanalysis（蛋白质组学技术）DonorAcceptor(2-10nm)ExcitationfrequencyEmissionfrequency=ExcitationfrequencyEmissionfrequencyFluorescenceResonanceEnergyTransfer(FRET)Donorisexcitedatthemaximumabsorbancewavelength(380nanometers)ofthedonorAcceptorsignalisincreasedattheacceptoremissionmaximum(510nanometers)ColordefiningGFPmutation(source)Blue(BFP)Y66HGreen(GFP)Y66WCyan(CFP)S65TYellowish(YFP)S65G,T203YRed(D.s.RFP)D.striataExcitation(max)382nm434nm488nm514nm558nmEmission(max)446nm476nm509nm527nm583nmSensitivitytophotobleachingHighLowLowModerateLowWavelengthoftheFluorescentProteins•Measureinteractionsbetweentwoproteinsinvivo•Verysensitive•Excellentresolution•Helpfulincharacterizingmajorconformationalchangesinmacromolecules•DeterminetheinteractionqualitativelyandquantitativelyAdvantagesofFRETLimitationsofFRET•FRET