一概述二致病菌的初筛及鉴定系统

食品中致病菌的初筛鉴定和污染源的追溯------分子生物学技术在食品检验中的应用张志坤2009.3.10大纲一.概述二.致病菌的初筛及鉴定系统(一).目前食品安检中致病菌常规的检测方法(二).常规检测方法的优缺点(三).食品微生物检测的发展趋势(四).分子生物学理论基础(五).分子生物学检测技术---PCR技术和Real-TimePCR技术详解(六).分子生物学检测技术---生物芯片技术（探针技术）简介(七).分子生物学检测技术的优缺点(八).分子生物学鉴定技术简介三.致病菌污染源的追溯系统(一).概述(二).目前常用的污染源追溯方法---PFGE电泳方法简介(三).DuPont公司RiboPrinter®System简介一.概述微生物检测常规微生物检测致病微生物检测常规微生物项目：细菌总数、大肠菌群、大肠杆菌、酵母总数、霉菌总数，此类细菌不致病，但会严重影响食品的外观及风味。目前常用微生物培养法来计数菌落，允许有该类菌落，但菌落总数不能超标。致病微生物项目：沙门氏菌、李斯特菌、金黄色葡萄球菌、大肠杆菌O157：H7、弯曲杆菌、致病弧菌、副溶血弧菌、志贺氏菌、假单胞菌等。致病微生物在食品中是绝对不允许存在的，所以快速检测食品中是否存在有致病微生物，是食品安全检验的重中之重。下面我们重点来谈一下致病菌的检验方法。食品微生物检测一.概述食品中致病微生物的检测致病微生物检测致病微生物检出及鉴定污染源的追溯为什么要进行污染源的追溯?1.可以搞清楚致病菌污染的源头,进而分析出污染爆发的原因;2.可以更为有效地消除污染源,杜绝污染的再次爆发;3.在食品生产的各个环节可以有效地进行质控.二.初筛及鉴定常规检测步骤：收集样品无选择性富集细菌（4-8小时）选择性的富集增菌（18-24小时）1.平板培养纯化细菌，根据菌落形态，生理生化特征等检测。2.免疫检测收集样品富集细菌选择增菌培养检测免疫检测(一).目前食品安检中致病菌常规的检测方法二.初筛及鉴定1.生物梅里埃选择性培养基平板法（1）.chromID™阪崎肠杆菌显色平板2种显色底物用来显示2种阪崎肠杆菌的特异性酶活性：α-D-吡喃葡萄糖苷酶glucopyranosidaseandβ-D-纤维二糖酶,并可以检测低活性的α-D吡喃葡萄糖苷酶菌株。抗生素用来抑制大多数革兰氏阳性菌、酵母菌和一些革兰氏阴性菌的生长24小时培养后获得典型的菌落（蓝灰色到蓝黑色），48小时培养后出现特有的菌落形态。因此可以在48小时一次判读结果。35-37°C和41.5°C培养均通过评估，通过评估可在mLST＋新生霉素或EE肉汤增菌培养后使用(FDA/CFSAN:2002)（2）.chromID沙门菌显色平板特异性:3种显色底物能更好地选择性分离和区分包括伤寒沙门氏菌、副伤寒沙门氏菌和绝大多数乳糖阳性地沙门氏菌在内的沙门氏菌。营养成份:在强选择性成分作用下，沙门氏菌经过37°C18-24小时培养形成较大、边缘不规则、显色明显的菌落。选择性:强选择性确保抑制污染食物的其它菌落如：革兰阳性球菌、酵母菌和大部分非发酵革兰阴性细菌。(一).目前食品安检中致病菌常规的检测方法二.初筛及鉴定2.生物梅里埃免疫检测法---VIDAS系统VIDAS金葡菌肠毒素葡菌肠毒素是引起食物中毒的常见原因。7种不同的血清型可被鉴定。这些毒素蛋白最初仅由金黄色葡萄球菌产生，但目前有报道中间型葡萄球菌和猪葡萄球菌也能产生毒素。尽管葡萄球菌可通过加热破坏，但这些毒素是热稳定性的，可在高温下存活。生物梅里埃采用尖端科技的ELFA技术，运用能更好的捕获抗原的新抗体工作。移去粘附在酶结合抗体上的Fc片断，明显增强了试剂盒的性能。移去Fc片断减少了可能产生潜在错误信号干扰的食物成份和非特异性结合的其它细菌，提高了特异性。释放2个小的Fab’片断优化了抗体的位置，更好地结合抗原，提高了敏感性.VIDASSET2是一个由包含成品试剂和SPR（固项容器）管组成的单剂量试剂。VIDAS全自动仪器进行整个检测步骤并打印结果：阳性或阴性检测食品中的葡萄球菌毒素检测时间:80分钟整个检测周期:少于1天(一).目前食品安检中致病菌常规的检测方法二.初筛及鉴定1.常规检测方法的优点(1).直观由于常规检测方法是用微生物的培养法来进行的，所以此类方法很直观，经过一定时间的培养后，进行菌落形态和细菌形态及细菌生理生化的鉴定，有没有一目了然，非常直观。(2).经济由于常规方法不需要特殊的试剂，显色培养基和普通染色镜检即可完成检验和鉴定，所以成本低廉。2.常规检测方法的缺点(1).周期长由于常规检测用的是微生物的培养法，需要不断的选择性培养纯化，再加上生理生化的鉴定，周期非常长（一周左右）。(2).不能准确鉴定变种致病菌打个比方，常规的鉴定方法就像鉴定一个人一样，先看人群的形态（物以类聚，人以群分，类似于菌落形态），再看此人穿什么样的衣服（类似于有无鞭毛和荚膜），接下来看此人的外貌（有无特殊的标志，类似于细菌的形态学观察），最后看此人的习惯（类似于细菌的生理生化特点，遇染色培养基变色等）。但是细菌的变异率是非常高的，遇见变异的致病菌和未知的致病菌，我们往往会束手无策，常常会得出是是而非的结论。(二).常规检测方法的优缺点二.初筛及鉴定1.准确这是任何一种检测方法的基本要求，其他有点要在此基础上建立。对于变异的致病菌和未知的细菌也要能准确无误的做出鉴定。2.快速灵敏高效，操作简便在准确的基础上，能够快速得出检测的结果，以减轻仓储和物流的压力，达到快速出货加快产品流通的目的。3.能有效的避免样品检测中带来的交叉污染在微生物的检测中，样品间的交叉污染是个让人十分头疼的问题，好的检测方法应该能有效的避免交叉污染的发生。4.经济检测成本不能太高，尽量减少企业的检验成本。5.和国际标准接轨随着我国加入世贸组织，国内企业越来越多的产品走向了世界，但其他国家为了保护本国企业的利益，往往会在检验标准上设置贸易壁垒，所以这就要求我们的检验标准和国际检验标准接轨，这样才能顺利的把我们的产品销往国外。（以上是本人自己总结的几点，希望各位同仁能够不断添加。）(三).食品微生物检测的发展趋势二.初筛及鉴定1.分子生物学检测技术是基于基因水平的检验技术。基因决定着生物的种类和性状。大千世界，各种生物千姿百态，这一切皆源于各种生物所携带基因的差异。随着科技的不断发展，人们认识物种的水平已经从形态及生理生化水平进入到了基因水平。举个例子来说，门，纲，目，科，属，种，亚种，人类都是属于同一个种---人种，人种又可分为黄，白，黑，棕等亚种；就拿黄种人来说吧，不同的生物，其基因也是不同的，这就是DNA鉴定的理论基础。在致病菌的检验上，我们同样可以用DNA---这个基因的载体来进行检验和鉴定。2.首先让我们来认识一下基因、DNA和核酸。基因是一段核酸序列，用来编码特定的氨基酸序列，和指导蛋白质合成及加工，从而使生物体具有特殊的性状。核酸经水解可得到很多核苷酸，因此核苷酸是核酸的基本单位。核酸就是由很多单核苷酸聚合形成的多聚核苷酸。核苷酸可被水解产生核苷和磷酸，核苷还可再进一步水解，产生戊糖和含氮碱基。核苷酸中的碱基均为含氮杂环化合物，它们分别属于嘌呤衍生物和嘧啶衍生物。核苷酸中的嘌呤碱(purine)主要是鸟嘌呤(guanine,G)和腺嘌呤(adenine,A)；嘧啶碱(pyrimidine)主要是胞嘧啶(cytosine,C)、尿嘧啶(uracil,U)和胸腺嘧啶(thymine,T)。DNA和RNA都含有鸟嘌呤(G)、腺嘌呤(A)和胞嘧啶(C)；胸腺嘧啶(T)一般而言只存在于DNA中，不存在于RNA中；而尿嘧啶(U)只存在于RNA中，不存在于DNA中。核酸脱氧核糖核酸（DNA）,其戊糖环为脱氧戊糖核糖核酸（RNA）,戊糖环为非脱氧戊糖(四).分子生物学理论基础二.初筛及鉴定细胞结构图(四).分子生物学理论基础二.初筛及鉴定2.首先让我们来认识一下基因、DNA和核酸。核酸核苷+磷酸戊糖+磷酸+碱基，其分子式如下图：水解水解(四).分子生物学理论基础二.初筛及鉴定2.首先让我们来认识一下基因、DNA和核酸核酸的性质：1.核酸链一般都是以双链存在的，尤其是DNA链。两条链之间以碱基所形成的氢键连接，形成双螺旋结构。碱基之间的连接是有严格的配对原则的即:A-T;G-C。如下图：(四).分子生物学理论基础二.初筛及鉴定2.首先让我们来认识一下基因、DNA和核酸核酸的性质：1.核酸链一般都是以双链存在的，尤其是DNA链。两条链之间以碱基所形成的氢键连接，形成双螺旋结构。碱基之间的连接是有严格的配对原则的即:A-T;G-C。如下图：(四).分子生物学理论基础二.初筛及鉴定2.首先让我们来认识一下基因、DNA和核酸核酸的性质：2.核酸的变性，复性和杂交DNA双链之间以氢键连接，氢键是一种次级键，能量较低，易受破坏，在某些理化因素作用下，DNA分子互补碱基对之间的氢键断裂，使DNA双螺旋结构松散，变成单链，即为DNA变性。DNA变性只涉及二级结构改变，不伴随一级共价键的断裂。DNA的变性从开始到解链完全，是在一个相当窄的温度内完成的，在这一范围内，紫外光吸收值增加达到最大增加值的50％时的温度叫做DNA的解链温度（Tm）。一种DNA分子的Tm值的大小与其所含碱基中的G＋C的比例相关也与DNA分子大小及变性条件有关，G+C的比例越高，DNA分子越长，溶液离子强度越高，Tm值越大。④加热、低盐及强酸、强碱均可使DNA变性。2.复性变性DNA在适当条件下，两条互补链可重新恢复天然的双螺旋构象，这种现象称为复性。热变性的DNA经缓慢冷却后即可复性，这一过程也叫退火，一般认为，比Tm值低25℃的温度是DNA复性的最佳条件。3.DNA复性的实际应用——杂交：通过变性DNA的复性性质，我们可知道，DNA单链之间、RNA单链之间、一条DNA和一条RNA链之间只要存在序列互补配对区域，不管是整条链互补，还是部分序列互补，即可重新形成整条双链或部分双链，这即为核酸分子杂交，这在分子生物学研究中有极大的应用，比如：可用于在基因组中对特异基因的定位及检测，PCR技术扩增目的基因等，很多分子生物学实验技术应用的都是核酸分子杂交的原理，如SouthernBlot,NorthernBlot,这个性质也是PCR的理论基础。(四).分子生物学理论基础二.初筛及鉴定2.首先让我们来认识一下基因、DNA和核酸核酸的性质：2.核酸的变性，复性和杂交变性复性杂交(四).分子生物学理论基础二.初筛及鉴定1.PCR概论聚合酶链锁反应，Polymerasechainreaction，简称PCR，PCR这项技术是由凯利·穆利斯(KaryMullis)发明，并因此在七年之后，1993年10月，获得了诺贝尔化学奖该项殊荣。穆利斯的想法是，利用一种人工方法，和反覆相同程序的方法，并利用一种特殊的酶——即DNA聚合酶来扩增特定的DNA片段。DNA聚合酶天然存在于生物体内，在细胞分裂前进行DNA的复制。当DNA开始复制时，解旋酶将双股的DNA分开成两个单股。DNA聚合酶便结合在两DNA单股链上，生成互补链。在穆利斯最初的PCR反应中，将DNA聚合酶用于体外试验。双链DNA被加热到96℃，使得双链分离成为两条单链。但是在这个温度下，DNA聚合酶被破坏，因此在每个循环的加热步骤后必须补充新的聚合酶。穆利斯的原始PCR反应效率极低，需要大量时间和DNA聚合酶，并且在整个PCR反应中都需要人来照看。后来，由嗜热细菌水生栖热菌(Thermusaquaticus)体内产生的DNA聚合酶改善了这种低效的PCR反应。由于嗜热细菌生活在温度超过110℃的间歇泉中，它的DNA聚合酶具有耐热性。在用于PCR反应时，高温并不能破坏这种DNA聚合酶，因此不需要不断加入新的聚合酶，PCR反应由此变得简单并且可以由机器操作。最初的具有耐热性的DNA聚合酶来自于水生栖热菌(Thermusaquaticus)，因此被称为Taq。Taq酶被广泛用于当前的PCR操作中。Taq酶的缺点是它缺少3'-5'校正外切酶活性，