链霉菌RNA提取

5.5.10转录谱的测定5.5.10.1链霉菌总RNA的提取①液体培养基中生长的菌体经离心收集并用吸水纸洗干（固体培养时，应在培养基表面铺上玻璃纸，刮取生长在玻璃纸表面的菌体），迅速放入用液氮预冷的研钵中，研磨至粉末状；②取50-100mg菌体放入预冷的无RNase污染的离心管中（15磅灭菌1小时），迅速加入1mlTrizol试剂，用微量移液器吹匀并在振荡器上振荡2分钟，室温放置5分钟后12,000g，4°C离心10min；③将上清转移至一新的离心管中，加入200l氯仿，充分混匀，室温放3分钟后于12,000g，4°C离心15min；④将上清转移至一新的离心管中，再加入200l氯仿抽提一次，12,000g，4°C离心10min；⑤将上清转移至一新的离心管中，加入500l异丙醇，-20°C或-70°C沉淀30min，12,000g，4°C离心10min；⑥弃上清，加入1ml70％乙醇洗两次，室温干燥后加入适当体积的DEPC处理过的H2O溶解，-70°C冻存，或用甲酰胺溶解RNA沉淀贮存于-20°C。5.5.10.2DNase处理RNA样品RNA样品用RQ-RNasefreeDNase（50μl体系加1μl酶）处理1h，加水至500μl，酚、氯仿抽提后，加1/10体积的3M醋酸钠（pH5.0），2倍体积的无水乙醇沉淀，最后溶解于适量的水中。PCR是否有DNA污染。5.5.10.3RNA浓度和纯度的检测①利用紫外分光光度计测定所提取RNA在260和280nm的光吸收值，确定RNA的纯度和浓度。纯净RNA样品的OD260/OD280比值应介于1.9和2.05之间，比值小于1.8表明蛋白污染，大于2.1可能是降解严重。根据OD260为1相当于40μg/mlRNA来计算浓度。②用普通凝胶电泳或甲醛变性电泳检测RNA的完整性，凝胶浓度为1.0%，RNA上样量为5-10μg，电压为5V/cm，溴酚蓝迁移距离8cm左右停止电泳，EB染色后紫外光下观察RNA特征带。（1%甲醛变性胶：88mlDEPC灭菌水中加入1.2g琼脂糖，煮沸，冷却至60°C加入12ml10×MOPS缓冲液和20ml37％甲醛，混匀。）所用电泳槽和电泳缓冲液均需无RNase污染。5.5.10.4cDNA文库的制备5×First-Strandbuffer8l10mMdNTPs2l随机引物N15500ng0.1MDDT1lRNA模板3µgRNaseInhibitor（Fermantas）1µlSuperScriptIII（400U/l）2µlNuclease-freeddH2O至40µl采用InvitrogenSuperScriptIII反转录酶的说明书，每个反应体系40μl。含RT-PCR程序设置如下：50°C，45min；55°C，45min；45°C，45min；72°C，2min。5.5.10.5cDNA的半定量选用链霉菌的hrdB基因作为内参，以制备好的cDNA文库作为模版进行PCR扩增。相应的PCR程序如下：94°C，4min（预变性），紧接着30个循环：94°C，1min；55°C，30s；72°C，35s。分别在程序进行至16，18，20，22，24，26，28，32循环时，取5l样品琼脂糖凝胶电泳检测。10×Taq通用buffer（购自Takara公司）10l2.5mMdNTPs10lRThrdB150pmolRThrdB250pmolcDNA文库1.5µlDMSO4µlTaqDNA聚合酶（5U/l）2µlNuclease-freeddH2O至100µlTRIzol使样品匀浆化，细胞裂解，溶解细胞内含物，同时因含有RNase抑制剂可保持RNA的完整性。在加入氯仿离心后，溶液分为水相和有机相，RNA在水相中。取出水相用异丙醇沉淀可回收RNA；用乙醇沉淀中间层可回收DNA；用异丙醇沉淀有机相可回收蛋白质。RNA提取步骤RNA的提取准备试剂：氯仿，异丙醇，75℅乙醇，无RNase的水或0.5℅SDS(溶液均需用DEPC处理过的水配制)操作步骤:1.匀浆处理:a.组织将组织在液氮中磨碎,每50-100mg组织加入1mlTRIzol,用匀浆仪进行匀浆处理。样品体积不应超过TRIzol体积10℅。b.单层培养细胞直接在培养板中加入TRIzol裂解细胞，每10cm2面积(即3.5cm直径的培养板)加1ml，用移液器吸打几次。TRIzol的用量应根据培养板面积而定，不取决于细胞数。TRIzol加量不足可能导致提取的RNA有how(event)class=t_tagDNA污染。c．细胞悬液离心收集细胞，每5-10×106动物、植物、酵母细胞或1×107细菌细胞加入1mlTRIzol，反复吸打。加TRIzol之前不要洗涤细胞以免mRNA降解。一些酵母和细菌细胞需用匀浆仪处理。2．将匀浆样品在室温（15-30℃）放置5分钟，使核酸蛋白复合物完全分离。3．可选步骤：如样品中含有较多蛋白质，脂肪，多糖或胞外物质（肌肉，植物结节部分等）可于2-8℃10000×g离心10分钟，取上清。离心得到的沉淀中包括细胞外膜，多糖，高分子量DNA，上清中含有RNA。处理脂肪组织时，上层有大量油脂应去除。取澄清的匀浆液进行下一步操作。5.每使用1mlTRIzol加入0.2ml氯仿，剧烈振荡15秒，室温放置3分钟。6.2-8℃10000×g离心15分钟。样品分为三层：底层为黄色有机相，上层为无色水相和一个中间层。RNA主要在水相中，水相体积约为所用TRIzol试剂的60℅。7.把水相转移到新管中，如要分离DNA和蛋白质可保留有机相，进一步操作见后。用异丙醇沉淀水相中的RNA。每使用1mlTRIzol加入0.5ml异丙醇，室温放置10分钟。8.2-8℃10000×g离心10分钟，离心前看不出RNA沉淀，离心后在管侧和管底出现胶状沉淀。移去上清。9.用75℅乙醇洗涤RNA沉淀。每使用1mlTRIzol至少加1ml75℅乙醇。2-8℃不超过7500×g离心5分钟，弃上清。10.室温放置干燥或真空抽干RNA沉淀，大约晾5-10分钟即可.不要真空离心干燥，过于干燥会导致RNA的溶解性大大降低。加入25-200μl无RNase的水或0.5℅SDS,用枪头吸打几次,55-60℃放置10分钟使RNA溶解.如RNA用于酶切反应,勿使用SDS溶液。RNA也可用100℅的去离子甲酰胺溶解，-70℃保存。注意事项：1.从少量样品（1-10mg组织或102-104细胞）中提取RNA时可加入少许糖原以促进RNA沉淀。例如加800mlTRIzol匀浆样品，沉淀RNA前加5-10μgRNase-free糖原。糖原会与RNA一同沉淀出来，糖原浓度不高于4mg/ml是不影响第一链的合成，也不影响PCR反应。2．匀浆后加氯仿之前样品可以在-60至-70℃保存至少一个月。RNA沉淀可以保存于75%酒精中2-8℃一星期以上或-5至-20℃一年以上。3．分层和RNA沉淀时也可使用台式离心机，2600×g离心30-60分钟。预期产量：1mg组织或1×106细胞提取RNA分别为：肝和脾6-10μg,肾3-4μg,骨骼肌和脑组织1-1.5μg,胎盘1-4μg,上皮细胞8-15μg,成纤维细胞5-7μg。常见问题分析：得率低：A.样品裂解或匀浆处理不彻底B．RNA沉淀未完全溶解A260/A2801.65：A.检测吸光度时，RNA样品没有溶于水，而溶于了TE中。低离子浓度和低pH值条件下A280值偏高B．样品匀浆时加的试剂量太少C．匀浆样品时未在室温放置5分钟D．吸取水相时混入了有机相E．RNA沉淀未完全溶解。RNA降解：A.组织取出后没有马上处理或冷冻B.待提取RNA的样品没有保存于-60至-70℃,而保存在了-5至-20℃C.细胞在用胰酶处理时过度D.溶液或离心管未经RNase去除处理E.电泳时使用的甲醛pH值低于了3.5DNA污染:A.样品匀浆时加的试剂量太少B.样品中含有有机溶剂(如乙醇,DMSO等),强缓冲液或碱性溶液蛋白聚糖和多糖污染:沉淀RNA的过程中作以下改进可去除这些污染，步骤7中,每使用1mlTRIzol在水相中加0.25ml异丙醇和0.25ml高盐溶液(0.8M柠檬酸钠和1.2MNaCl)混合离心,按之前操作进行。这种方法可使蛋白聚糖和多糖留在溶液中，高效沉淀出纯RNA。从含有大量多糖的植物中提取RNA时应在匀浆后离心，并加上以上操作步骤。