控制菌检查法

控制菌检查控制菌检查用的培养基应进行培养基的适应性检查，成品培养基、由脱水培养基或按培养基处方配置的培养基均应检查。菌种试验用菌种的传代次数不得超过5代（从菌种保藏中心获得的冷冻干燥菌种为第0代），并采用适宜的菌种保藏技术进行保存，以保证试验菌株的生物学特性。大肠埃希菌（Escherichiacoli）[CMCC(B)44102或CVCC1570]金黄色葡萄球菌（Staphyloccocusaureus）[CMCC(B)26003或CVCC1882]乙型副伤寒沙门菌（SalmonellaparatyphiB）[CMCC(B)50094]铜绿假单胞菌（Pseudomonasaeruginosa）[CMCC(B)10104]生孢梭菌（Clostridiumsporogenes）[CMCC(B)64941]白色念珠球菌（canidiaalbicans）[CMCC(F)98001]菌液制备接种大肠埃希菌、金黄色葡萄球菌、乙型副伤寒沙门菌、铜绿假单胞菌的新鲜培养物至营养肉汤培养基或营养琼脂培养基上，生孢梭菌的新鲜培养物至硫乙醇酸盐流体培养基中，培养18～24小时；接种白色念珠球菌的新鲜培养物至改良马丁培养基中或改良马丁琼脂培养基上，培养18～24小时。用0.9%无菌氯化钠溶液制成每1ml含菌数为10～100cfu的菌悬液。菌悬液在室温下放置应在2小时内使用，若保存在2～8℃可在24小时内使用。适应性检查控制菌检查用培养基的适应性检查项目包括促生长能力、抑制能力及指示能力的检查。表1控制菌检查用培养基的促生长能力、抑制能力及指示能力检查控制菌检查培养基特性试验菌株大肠埃希菌胆盐乳糖培养基促生长能力大肠埃希菌抑制能力金黄色葡萄球菌4-甲基伞形酮葡萄糖苷酸培养基促生长能力+指示能力大肠埃希菌曙红亚甲基蓝琼脂培养基或麦康凯琼脂培养基促生长能力+指示能力大肠埃希菌大肠菌群乳糖胆盐发酵培养基促生长能力大肠埃希菌抑制能力金黄色葡萄球菌乳糖发酵培养基促生长能力+指示能力大肠埃希菌曙红亚甲基蓝琼脂培养基或麦康凯琼脂培养基促生长能力+指示能力大肠埃希菌沙门菌营养肉汤培养基促生长能力乙型副伤寒沙门菌四硫磺酸钠亮绿培养基促生长能力乙型副伤寒沙门菌抑制能力金黄色葡萄球菌胆盐硫乳琼脂培养基或沙门、志贺菌属琼脂培养基促生长能力+指示能力乙型副伤寒沙门菌曙红亚甲基蓝琼脂培养基或麦康凯琼脂培养基促生长能力+指示能力乙型副伤寒沙门菌三糖铁琼脂培养基指示能力乙型副伤寒沙门菌控制菌检查培养基特性试验菌株铜绿假单胞菌胆盐乳糖培养基促生长能力铜绿假单胞菌抑制能力金黄色葡萄球菌溴化十六烷基三甲铵琼脂培养基促生长能力铜绿假单胞菌抑制能力大肠埃希菌绿脓菌素测定用培养基促生长能力+指示能力铜绿假单胞菌金黄色葡萄球菌亚碲酸盐肉汤培养基促生长能力金黄色葡萄球菌抑制能力大肠埃希菌卵黄氯化钠琼脂培养基或甘露醇氯化钠琼脂培养基促生长能力+指示能力金黄色葡萄球菌抑制能力大肠埃希菌梭菌梭菌增菌培养基促生长能力生孢梭菌哥伦比亚琼脂培养基促生长能力生孢梭菌白色念珠菌沙氏葡萄糖液体培养基促生长能力白色念珠菌沙氏葡萄糖琼脂培养基促生长能力+指示能力白色念珠菌念珠菌显色培养基促生长能力+指示能力白色念珠菌抑制能力大肠埃希菌1%聚山梨酯80-玉米琼脂培养基促生长能力+指示能力白色念珠菌液体培养基促生长能力检查分别接种不大于100cfu的试验菌（表1）于被检培养基和对照培养基中，在相应控制菌检查规定的培养温度及最短培养时间下培养。与对照培养基管比较，被检培养基管试验菌应生长良好。固体培养基促生长能力检查取试验菌各0.1ml（含菌数50～100cfu）分别涂布于被检培养基和对照培养基平板上，在相应控制菌检查规定的培养温度及最短培养时间下培养。被检培养基和对照培养基上生长的菌落大小、形态特征应一致。培养基抑制能力检查接种不少于100cfu的试验菌（表1）于被检培养基中，在相应控制菌检查规定的培养温度计最长时间下培养，试验菌应不得生长。固体培养基指示能力检查取试验菌各0.1ml（含菌数50～100cfu）分别涂布于被检培养基和对照培养基平板上，在相应控制菌检查规定的培养温度培养时间下培养。被检培养基上试验菌生长的菌落大小、形态特征、指示剂反应情况等应与对照培养基一致。液体培养基指示能力检查分别接种不大于100cfu的试验菌（表1）于被检培养基和对照培养基中，在相应控制菌检查规定的培养温度及最短培养时间下培养。与对照培养基管比较，被检培养基管试验菌生长情况、指示剂反应等应与对照培养基一致。控制菌检查方法的验证当建立兽药的微生物限度检查法时，应进行控制菌检查方法的验证，以确认所采用的方法适合于该兽药的控制菌检查。若兽药的组分或原检验条件发生改变可能影响检验结果时，检查方法应重新验证。验证时，依各品种项下微生物限度标准中规定检查的控制菌选择相应验证的菌株，验证大肠菌群检查法时，采用大肠埃希菌作为验证菌株。验证试验按供试液的制备和控制菌检查法的规定及下列要求进行。菌种及菌液制备同控制菌检查用培养基的适应性检查。验证方法取规定量供试液及10～100cfu试验菌加入增菌培养基中，依相应控制菌检查法进行检查。当采用薄膜过滤法时，取规定量供试液，过滤，冲洗，验证菌应加在最后一次冲洗液中，过滤后，注入增菌培养基或取出滤膜接入增菌培养基中。结果判断若上述试验检出试验菌，按此供试液制备法和控制菌检查法进行供试品的该控制菌检查；若未检出试验菌，应采用培养基稀释法、离心沉淀法、薄膜过滤法、中和法等方法或联合使用这些方法消除供试品的抑菌活性，并重新进行方法验证。验证试验也可以与供试品的控制菌检查同时进行。供试品检查供试品的控制菌检查应按已验证的方法进行。阳性对照试验进行供试品控制菌检查时，应做阳性对照试验。阳性对照试验的加菌量为10～100cfu，方法同供试品的控制菌检查。阳性对照试验应检出相应的控制菌。阴性对照试验取稀释液10ml照相应控制菌检查法检查，作为阴性对照。阴性对照应无菌生长。（1）大肠埃希菌（Escherichiacoli）取供试液10ml（相当于供试品1g、1ml或10cm2），直接或处理后接种至适量（不少于100ml）的胆盐乳糖培养基中，培养18～24小时，必要时可延长至48小时。取上述培养物0.2ml，接种至含5mlMUG培养基的试管内培养，于5小时、24小时在366nm紫外灯下观察，同时用未接种的MUG培养基作本底对照。若管内培养基呈现荧光，为MUG阳性；不呈现荧光，为MUG阴性。观察后，沿培养管的管壁加入数滴靛基质试液，液面呈玫瑰红色，为靛基质阳性；呈试剂本色，为靛基质阴性。本底对照应为MUG阴性和靛基质阴性。如MUG阳性、靛基质阳性，判供试品检出大肠埃希菌；如MUG阴性、靛基质阴性，判供试品未检出大肠埃希菌；如MUG阳性、靛基质阴性，或MUG阴性、靛基质阳性，则应取胆盐乳糖培养基的培养物划线接种于曙红亚甲蓝琼脂培养基或麦康凯琼脂培养基的平板上，培养18～24小时。表2大肠埃希菌菌落形态特征培养基菌落形态曙红亚甲蓝琼脂紫黑色、浅紫色、蓝紫色或粉红色，菌落中心呈深紫色或无明显暗色中心，圆形，稍凸起，边缘整齐，表面光滑，湿润，常有金属光泽麦康凯琼脂鲜桃红色或微红色，菌落中心呈深桃红色，圆形，扁平，边缘整齐，表面光滑，湿润（2）大肠菌群（Coliform）取含适量（不少于10ml）的乳糖胆盐发酵培养基管3支，分别加入1：10的供试液1ml（含供试品0.1g或0.1ml）、1：100的供试液1ml（含供试品0.01g或0.01ml）、1:1000的供试液1ml（含供试品0.001g或0.001ml），另取1支乳糖胆盐发酵培养基管加入稀释液1ml作为阴性对照管。培养18～24小时。乳糖胆盐发酵管若无菌生长或有菌生长但不产酸产气，判该管未检出大肠菌群；若产酸产气，应将发酵管中的培养物分别划线接种于曙红亚甲蓝琼脂培养基或麦康凯琼脂培养基的平板上，培养18～24小时。若平板上无菌生长，或生长的菌落与表3所列的菌落形态特征不符或为非革兰阴性无芽孢杆菌，判该管未检出大肠菌群；若平板上生长的菌落与表3所列的菌落形态特征相符或疑似，且为革兰阴性无芽孢杆菌，应进行确证试验。表3大肠菌群菌落形态特征培养基菌落形态曙红亚甲蓝琼脂紫黑色、紫红色、红色或粉红色，圆形，扁平或稍凸起，边缘整齐，表面光滑，湿润麦康凯琼脂鲜桃红色或粉红色，圆形，扁平或稍凸起，边缘整齐，表面光滑，湿润确证试验从上述分离平板上挑选4～5各疑似菌落，分别接种于乳糖发酵管中，培养24～48小时。若产酸产气，判断该乳糖胆盐发酵管检查大肠菌群，否则判未检出大肠菌群。根据大肠菌群检出的管数，按表4报告1g或1ml供试品中的大肠菌群数。表4可能的大肠菌群数表各供试品量的检出结果可能的大肠菌群数Ｎ（个／ｇ或个／ｍｌ）0.1g或0.1ml0.01g或0.01ml0.001g或0.001ml＋＋＋＞１０３＋＋－１０２＜Ｎ＜１０３＋－－１０＜Ｎ＜１０２－－－＜１０注：＋代表检出大肠菌群；－代表未检出大肠菌群。（3）沙门菌（Salmonella）取供试品１０ｇ或10ml，直接或处理后接种至适量（不少于200ml）的营养肉汤培养基中，用匀浆仪或其他适宜的方法混匀，培养18～24小时。取上述培养物1ml，接种于10ml四硫磺酸钠亮绿培养基中，培养18～24小时后，分别划线接种于胆盐硫乳琼脂（或沙门、志贺菌属琼脂）培养基和麦康凯琼脂（或曙红亚甲蓝琼脂）培养基的平板上，培养18～24小时（必要时延长至40～48小时）。若平板上无菌生长或生长的菌落或不同于表5所列的特征，判断供试品未检出沙门菌。若平板上生长的菌落与表5所列的菌落形态特征相符或疑似，用接种针挑选2～3各菌落分别于三糖铁琼脂培养基高层斜面上进行斜面培养和高层穿刺培养接种，培养18～24小时，如斜面未见红色、底层未见黄色；或斜面黄色、底层无黑色，判供试品未检出沙门菌。否则，应取三糖铁琼脂培养基斜面的培养物进行适宜的鉴定试验，确认是否为沙门菌。表5沙门菌菌落形态特征培养基菌落形态胆盐硫乳琼脂无色至浅橙色，半透明，菌落中心带黑色或全部黑色或无黑色沙门、志贺菌属琼脂无色至淡红色，半透明或不透明，菌落中心有时带黑褐色曙红亚甲蓝琼脂无色至浅橙色，透明或半透明，光滑湿润的圆形菌落麦康凯琼脂无色至浅橙色，透明或半透明，菌落中心有时为暗色（4）铜绿假单胞菌（Pseudomonasaeruginosa）取供试液10ml（相当于供试品1g、1ml或10cm2），直接或处理后接种至适量（不少于100ml）的胆盐乳糖培养基中，培养18～24小时。取上述培养物，划线接种于溴化十六烷基三甲铵琼脂培养基的平板上，培养18～24小时。铜绿假单胞菌典型菌落呈扁平、无定形、周边扩散、表面湿润，灰白色，周围时有蓝绿色素扩散。如平板上无菌落生长或生长的菌落与上述菌落形态特征不符，判供试品未检出铜绿假单胞菌。如平板上生长的菌落与上述菌落形态特征相符或疑似，应挑选2～3个菌落，分别接种于营养琼脂培养基斜面上，培养18～24小时。取斜面培养物进行革兰染色、镜检及氧化酶试验。氧化酶试验取洁净滤纸片置于平皿内，用无菌玻棒取斜面培养物涂于滤纸片上，滴加新配制的1%二盐酸二甲基对苯胺试液，在30秒内若培养物呈粉红色并逐渐变为紫红色为氧化酶试验阳性，否则为阴性。若斜面培养物为非革兰阴性无芽孢杆菌或氧化酶试验阴性，均判供试品未检出铜绿假单胞菌。否则，应进行绿脓菌素试验。绿脓菌素（Pyocyanin）试验取斜面培养物接种于PDP琼脂培养基斜面上，培养24小时，加三氯甲烷3～5ml至培养管中，搅碎培养基并充分振摇。静置片刻，将三氯甲烷相移至另一试管中，加入1mol/L盐酸溶液约1ml，振摇后，静置片刻，观察。若盐酸溶液呈粉红色，为绿脓菌素试验阳性，否则为阴性。同时用未接种的PDP培养基斜面同法做阴性对照，阴性对照试验应呈阴性。若上述疑似菌为革兰阴性杆菌、氧化酶试验阳性及绿脓菌素试验阳性，判供试品检出铜绿假单胞菌。若上述疑似菌为革兰阴性杆菌、氧化酶试验阳性及绿脓菌素试验阴性，应继续进行适宜的鉴定试验，