第十三章遗传工程动物

1第十三章遗传工程动物2第一节概述第二节转基因动物技术的发展概况第三节遗传工程动物的制备方法第四节遗传工程动物的建系和保种第五节遗传工程动物的应用3第一节概述概念基因（Gene）：位于染色体上具有遗传效应的DNA片断。三类：1.编码蛋白质：DNAmRNAProtein2.编码RNA：DNArRNA&tRNA3.调控序列基因组（Genome）：储存有生物体内全部遗传信息的全套染色体，称之为基因组。外源基因（ForeigngeneorTransgene）：外来的、非自身基因成分。4•基因型：生物所具有的基因成分，叫基因型（Genotype)•表现型：生物所显示的遗传性状，叫表现型（Phenotype)•纯合子：一对等位基因彼此相同，叫纯合子（Homozygote)•杂合子：一对等位基因彼此不同，叫杂合子（Heterozygote)•半合子：一条染色体上增加了一个外源基因，叫半合子（Semizygote)5外源基因构件（construct）:将外源基因片段通过分子生物学的方法组合起来，以达到设计的目的。这种重组的DNA片段称为外源基因构件。载体（vector）：带有宿主DNA序列的外源基因构件称为载体。它起着将外源基因构件带到特定位置的作用。6遗传工程动物的定义遗传工程动物（GeneticallyengineeredAnimals）是指将外源基因或经改造的自身基因片段导入动物受精卵或早期胚胎，使之稳定整合于宿主的染色体基因组内，并能遗传给后代的一类动物。遗传工程动物亦有称为基因修饰动物（Genemodifiedanimals)。遗传工程动物包括所有用遗传工程技术制备的动物，但有时人们常把“转基因动物”泛指为“遗传工程动物”。狭义的转基因动物一般仅指用显微注射法和逆转录病毒法制备的，即“加入”一个外源基因的动物。7遗传工程动物的分类转基因动物（Transgenicanimals)：加入一个外源基因基因敲除动物(Geneknockoutanimals)：使一个基因功能失活基因敲入动物(Geneknockinanimals)：加入或替换一个基因染色体工程动物(Chromosomeengineeredanimals)：使染色体片断缺失、易位、倒置、重复8转基因和基因敲除疾病相关或功能未知基因功能获得“加法”“减法”功能缺失?91980年，Gordon等把HSV-tk的基因显微注射到小鼠受精卵的原核中，获得了两只转基因小鼠，创建了显微注射转基因方法。1982年Palmiter等将大鼠的生长素基因和牛的生长素基因分别注射到小白鼠的受精卵中，得到了体型巨大的“超级小鼠”。第二节遗传工程动物技术的发展概况101985年Smithies等首先在β球蛋白位点上进行基因打靶，获得基因敲除小鼠。1987年英国Roslin研究所研制成功-抗胰蛋白酶转基因绵羊，乳汁中分泌-抗胰蛋白酶含量高达30mg/L。1995年Ramirez-Solis等首先制作成功染色体重排小鼠。2000年McCreath等用体细胞基因打靶获得转基因绵羊，乳汁中分泌-抗胰蛋白酶含量高达650ugml。1994年Kim等发明锌指核酶（Zinc-fingernucleases，ZFN）技术，已经被成功用于好几个不同的系统，如小鼠细胞、人类细胞、斑马鱼、植物、果蝇、大鼠等进行基因敲除。11一、用显微注射法制备转基因动物（一）原理将带有完整序列的外源基因构件通过显微注射注入到受精卵的雄性原核中，外源基因随机插入并整合到染色体上的任意序列中。将显微注射后的受精卵经体外培养，移植到假孕动物的输卵管内。子代出生后用分子生物学方法鉴定，确认整合有外源基因的动物即为转基因动物。第三节遗传工程动物的制备方法12（二）步骤1.制备外源目的基因构件•外源基因构件必须包括：启动子、外源基因编码区、PolyA（终止）信号•启动子的组织特异性决定了外源基因表达的时空特异性：启动子表达的组织CMV各种组织WAP乳腺β-Lactoglobulin乳腺Albuminenhancer肝脏αmyosinheavychain心脏13用内切酶将基因片段切下来备用142.动物的准备1）供受精卵雌鼠：提供受精卵用于显微注射2）正常雄鼠：与供受精卵雌鼠交配产生受精卵3）受体（假孕）雌鼠：显微注射后胚胎的移植受体。为了使子宫内膜变化与胚胎着床同步，需要与结扎雄鼠交配4）结扎雄鼠：因输精管结扎，不会排精。与雌鼠交配，产生受体（假孕）雌鼠，不会受孕，但可使雌鼠黄体活化，维持妊娠状态。15鼠类供受精卵鼠正常雄鼠受体雌鼠结扎雄鼠鼠龄4～6周＞8周＞8周＞8周体重＞15克＞22克＞25克＞25克作用受精卵供体与供体雌鼠交配注射卵移植受体与受体雌鼠交配更换频率每次一般6～8个月每次一般6～8个月饲养每笼3～5只每笼1只1～3只与结扎雄鼠合笼每笼1只备注产过仔的较好结扎后两周用转基因实验需用的各类小鼠163.显微注射法制备转基因动物步骤♂♀外源基因鉴定方法：PCRSouthern结扎公鼠成年雌鼠假孕雌鼠DNA构件17超数排卵雌鼠10只有阴栓雌鼠数6～8只获得的受精卵数200～300个可注射的雄性原核卵数150～250个显微注射后存活的卵数100～200个每个受体移卵数20～40个受体数3～6只超数排卵与转基因实验18显微注射法制备转基因动物19显微注射法的优缺点优点：•方法经典，简便、可靠缺点：•显微注射的整合率低，只有5%。•只能加入基因，不能剔除或原位修饰。•整合是随机的，由于插入位点的关系，转基因表达有不确定性，有的高，有的低。•由于是随机整合，可能破坏重要的内源性DNA序列或激活细胞的致癌基因。•用原核显微注射产生的转基因动物常常是嵌合体，即并不是所有细胞都整合有外源基因。•不能在胚胎早期确定性别。20二、逆转录病毒法制备转基因动物（一）原理逆转录病毒是一类具有逆转录酶的RNA病毒，能将病毒RNA逆转录成双链DNA，进而整合到细胞染色体DNA中。利用这个特点，可将逆转录病毒改造成外源基因表达载体，用于基因治疗研究和转基因动物的制备。逆转录病毒科有三个亚科：RNA肿瘤病毒亚科慢病毒亚科泡沫病毒亚科21逆转录病毒结构弱病毒复制+ssRNA+ssRNA:-ssDNAssDNA:+ssDNA+ssRNA抵抗力逆转录LTR:Longterminalrepeat，在5‘末端具有启动子/调控序列作用，在3’末端具有polyA信号作用。ψ+：病毒包装信号，具有指导病毒RNA包装成病毒颗粒功能。Gag：编码核衣壳、衣壳和基质的功能。pol：编码整合酶和逆转录酶。env：编码包膜表面糖蛋白和转膜蛋白。dsDNAmRNAProtein生物的正常遗传信息流22（二）用逆转录病毒法制备转基因动物基本步骤构建病毒载体转染包装细胞收集病毒颗粒感染受精卵胚胎移植表达gag,pol,env细胞23逆转录病毒法制备转基因动物的优缺点优点转基因效率高单位点、单拷贝整合缺点随机整合携带外源DNA片段大小受限，一般小于10kb易产生嵌合体（mosaic)24三、ES细胞法介导基因敲除小鼠的制备（一）原理将ES细胞在体外培养、扩增后，用经过改造的外源基因打靶载体导入ES细胞内，在细胞水平用正负筛选法筛选外源基因定点整合的ES细胞株。将外源基因定点整合的ES细胞注入到囊胚期胚胎的囊胚腔内，在体外短暂培养后，移植到假孕小鼠的子宫内。出生的小鼠为ES细胞来源品系和囊胚供体品系之间的嵌合体。外源基因能否传给下一代取决于ES细胞在嵌合体动物中的嵌合程度，嵌合程度越高，ES细胞在嵌合体动物中分化成生殖细胞的可能性就越大。251.基因打靶载体的构建1）载体的两端有同源臂；2）外源基因；3）要有正负筛选基因正筛选：Neor基因（用G418筛选，杀死未整合的细胞）负筛选：tk基因（用Ganc筛选，杀死随机整合的细胞）tktk5’同源臂3’同源臂Neor图11-2打靶载体的构建示意图26同源臂同源臂外源基因Tk基因定点整合随机插入ES细胞正常细胞G418+Ganc培养液2.将打靶载体导入ES细胞内27正负筛选出来的ES细胞是否是我们想要的定点整合细胞，需要用分子生物学试验进行鉴定。Southernblot试验PCR283.用ES细胞介导法制作基因敲除小鼠♂♀PCRSouthern结扎公鼠成年雌鼠假孕雌鼠导入基因的ES细胞29将经筛选的外源基因定点整合的ES细胞注射到囊胚内304.基因敲除小鼠的建系♂嵌合体♀野生型杂合子杂合子1/4纯合子31由于常规的ES细胞注入到2倍体囊胚获得ES细胞遗传背景的子代需要经过嵌合体阶段，使得研究成本昂贵，研发周期长。近年来发展的四倍体补偿技术可以绕过嵌合体小鼠阶段，直接获得ES细胞遗传背景的小鼠。其方法是：将受体2细胞胚胎用电融合方法获得四倍体胚胎。培养到囊胚阶段后，将ES细胞注射到囊胚内，经短暂体外培养后将它移植于假孕第2天小鼠的子宫中。出生的子代全都是ES细胞遗传背景。其基本原理是四倍体胚胎具有明显的胚外组织限制性分布，基本不参与胎儿及胚外中胚层组织的发育。四倍体补偿技术能显著缩短基因修饰小鼠的研发，直接得到近交遗传背景动物，大大降低了研发成本，具有明显的技术优势。32传统技术最新四倍体补偿技术2细胞胚胎四倍体胚胎发育到囊胚囊胚内注入突变ES细胞胚胎移植ES细胞遗传背景杂合子电融合确定交配3.5天取囊胚囊胚内注入突变ES细胞胚胎移植ES细胞和囊胚来源的嵌合体嵌合体×野生型杂合子33ES细胞介导的转基因优缺点优点•能在细胞水平进行筛选。•能加入、剔除或替换某个基因，或进行小到一个或几个核苷酸修饰。缺点•ES细胞的培养条件苛刻、技术要求高，成本大。•不同ES细胞株的生殖系传播能力差异很大。•ES介导的转基因需要经过嵌合体这一中间步骤。34第四节遗传工程动物的建系和保种一、遗传工程小鼠的建系过程中的交配方式遗传工程小鼠建系的目的是使外源基因能够稳定地遗传给后代。转基因小鼠导入的外源基因可以在半合子状态表达，但表达的程度因整合位点的不同有所差异。由于用显微注射法和逆转录病毒制备的转基因都是随机整合的，用同一基因构件获得的数个转基因G0代小鼠可能整合位点各不相同，且有可能多位点整合，因此G0代小鼠应该单独与该品系野生型进行交配，而不应在不同G0代小鼠之间交配。35基因敲除小鼠由于在ES细胞内用同源重组方法一般仅灭活一个位点，根据孟德尔的遗传法则，同源染色体的一对等位基因中一个位点发生灭活，其基因功能由等位基因的另一个位点代替，从而不表现任何突变的形状。只有当一对等位基因的两个位点都灭活，即纯合子，才表现出基因敲除的性状。纯合子小鼠即是我们所希望得到的基因敲除小鼠。目前用的ES细胞大多来自129品系，其嵌合体一般与野生型C57BL/6回交。经过6代回交后，其遗传背景将是C57BL/6了。此时任何遗传背景对基因表达的影响将可通过与正常C57BL/6小鼠的比较而得到控制。36二、遗传工程小鼠品系的维持遗传工程小鼠品系是以半（杂）合子状态还是以纯合子状态维持好呢？从理论上讲以纯合子状态饲养繁殖最理想，因为建立了纯合子品系就能稳定遗传，不必每一代都进行基因型检测。但由于转基因小鼠的外源基因有可能是多位点整合的，要建立纯合子品系就必须对多位点整合的G0代小鼠的每个整合位点进行分离，形成单位点稳定遗传纯合子品系。在下列情况下必须以杂合子状态维持：①所研究的靶基因突变是致死的，纯合子可能在胚胎期或出生后早期死亡，或性成熟前死亡；②纯合子小鼠不育。此时需要对每一代的所有子代进行检测来确定基因型，因而工作量较大。应用条件性基因打靶技术是避免致死性突变的最有效途径。37转基因动物杂合子保种方法G0代整合检测+：杂合子外源基因检测野生型×+：杂合子野生型×+：杂合子野生型×未整合：弃去+：杂合子野生型×+：杂合子野生型×用于实验外源基因检测外源基因检测外源基因检测外源基因检测38G0代整合检测-：弃去+：杂合子×野生型G1代-：弃去+：杂合子×杂合子-：弃去+：纯合子G2代基因型、表型检测纯合子繁殖遗传工程动物建系和纯合子保种方法3940第五节遗传工程动