您好,欢迎访问三七文档
当前位置:首页 > 商业/管理/HR > 经营企划 > 琼脂糖凝胶电泳-配方与步骤
�RNA琼脂糖凝胶电泳:配制:1.0.5MEDTA(pH=8.0):100ml:称取18.61gNa2EDTA·2H2O(分子量372.24),加80mlddH2O剧烈搅拌,用NaOH调节PH值至8.0(约需2gNaOH).高压灭菌,室温保存。2.50×TAEloadingbuffer:(Trisacetate-EDTAbuffer)电泳缓冲液组分:2MTris-乙酸;100mMEDTA(pH=8.0)500mL:称121.1gTrisbase(分子量121.14),加800mlddH2O溶解,加57.1ml乙酸和50ml0.5MEDTA溶液(pH=8.0),搅拌,ddH2O定容至500mL.室温保存。3.1×TAEloadingbuffer:取20ml50×TAE,ddH2O定容至1L.室温保存。4.100×Sybergreen:500ul:取495ul1×TAE于1.5ml离心管,加入5ulSybergreen原液混匀,4℃锡纸避光保存。注意:Sybergreen原液需稀释10000倍;6×DNAloadingbuffer上样缓冲液需稀释六倍,最终稀释倍数应不小于1×。步骤:1.制备1%琼脂糖凝胶(大胶用70ml,小胶用50ml,我们用30ml):称0.3g琼脂糖置于100ml锥形瓶中,加入30ml1×TAE,瓶口倒扣小烧杯。微波炉加热煮沸3次,至琼脂糖全部融化,摇匀,即成1.0%琼脂糖凝胶液。2.胶板制备:取电泳槽内的有机玻璃内槽(制胶槽)洗干净,晾干,放入制胶玻璃板.取透明胶带将玻璃板与内槽两端边缘封好,形成模子.将内槽置于水平位置,并放好梳子.将冷却到65℃左右的琼脂糖凝胶液混匀小心地倒入内槽玻璃板上,使胶液缓慢展开,直到整个玻璃板表面形成均匀胶层.室温下静置直至凝胶完全凝固,垂直轻拔梳子,取下胶带,将凝胶及内槽放入电泳槽中.添加1×TAE电泳缓冲液至没过胶板为止.3.加样:样品制备:(10ul体系/样品槽)于0.25ml离心管中样品RNA(最后加):2ul/3ul/5ul6×DNAloadingbuffer:10/6=1.7ul100×Sybergreen:0.1ulDEPC水:至10ul(注意:加样前要先记下加样的顺序).分别将样品加入胶板的样品小槽内,每加完一个样品,应更换一个枪头,以防污染,加样时勿碰坏样品孔周围的凝胶面.4.电泳:加样后的凝胶板立即通电进行电泳,电压60-100V,样品由负极(黑色)向正极(红色)方向移动.电压升高,琼脂糖凝胶的有效分离范围降低.当溴酚蓝移动到距离胶板下沿约1cm处时,停止电泳.5.电泳完毕后,取出凝胶,利用科212凝胶成像系统,在紫外灯(transUV)下观察拍照保存.DNA存在则显示出红色荧光条带.RNA完美提出应该是三条带:28,18,5.8。28和18比较亮,而且28是18亮度的2倍,5.8基本很模糊,可有可无
本文标题:琼脂糖凝胶电泳-配方与步骤
链接地址:https://www.777doc.com/doc-6703500 .html