产几丁质酶的筛选及活力测定

产几丁质酶的筛选及活力测定一、实验材料1.菌种：白僵菌，或其他菌种及土壤采样等(菌种接种于PDA斜面上，28℃，80％RH培养14d后分别置于4℃和20℃备用。)2.试剂：DNS试剂:（称取3，5-二硝基水杨酸3．15g，加水500mL。，搅拌5s，水浴至45。然后逐步加入100mL0．2g/mL的氢氧化钠溶液，同时不断搅拌。直到溶液清澈透明(注意：在加入氢氧化钠过程中，溶液温度不要超过48℃)。再逐步加入四水酒石酸钾钠91．0g苯酚2．5g和无水亚硫酸钠2．5g。继续45C水浴加热，同时补加水300mL，不断搅拌，直到加入的物质完全溶解。停止加热，冷却至室温后，用水定容至1000mL。用烧结玻璃过滤器过滤，取滤液，储存在棕色瓶中，避光保存。室温下存放7d后可以使用。)几丁质酶基础培养基(g／L)：葡萄糖5．09，蛋白胨5．09，KH2P04、KCI、MgS04·7H20各0．59，FeS04·2H200．1g，pH7．0。几丁质酶诱导培养基(g／L)：蛋白胨5．09，KH2P04、KCI、MgS04·7H20各0．59，ZnS04·7H2020．01g，胶体几丁质10ml，pH7．0。（胶体几丁质固体培养基。0.5gK2HPO4，0.5gKH2PO4，0.5gMgSO4·H2O，0.1gFeSO4·7H2O，0.1gZnSO4·7H2O500ml1%胶体几丁质，500ml蒸馏水，15g琼脂，pH7.2，121℃灭菌15min，冷却至50℃左右倒平板）马铃薯培养基(PDA)；去皮的马铃薯200g切块，沸水煮30min，纱布过滤，20g蔗糖，209琼脂，加热至全部溶解，定容至1L。二、筛选1.初筛采用平板透明圈法。用0．1mL孢子悬液(1×107／mL)滴于几丁质平板的中央(每个样品重复3次)，28℃培养7d，其菌落周围有透明圈出现。用游标卡尺测量几丁质水解圈直径(R／ram)与菌落直径(C／mm)，计算R／C比值。2.复筛摇瓶发酵，即在300mL三角瓶中装入30mL基础培养基，用3mL孢子悬液(1×107／mL)接种，28℃，160r／rain旋转摇床培养96h。相同条件下接入几丁质酶诱导培养基培养24h。离心发酵液(3000r／min，20min)的上清液即为粗酶液，测定酶活力。3.几丁质酶活性测定取0．5mL粗酶液与0．5mL含1．0％胶体几丁质的磷酸缓冲液(0．1M，pH6．0)混合，50℃保温1h，煮沸5min，冰浴冷却，10000r／min离心5min，取上清液加入DNS试剂1mL。于100℃加热10min，冰浴冷却，离心后取上清液在波长540nm下测吸光度。以N一乙酰氨基葡萄糖做标准对照。酶活力单位定义：在上述条件下，每小时产生1μmol还原糖所需酶量定义为1个酶活力单位。(采用DNS(3，5一二硝基水杨酸)比色法。，测定还原糖含量，其标准曲线的回归方程为Y=0．8405x+0．0099，式中x为N一乙酰葡萄糖质量(mg)，Y为吸光值，R2=0．9962。在3根1．5“离心管中分别加入0．5ml待测液和0．5nd浓度l％胶体几丁质；向其中I根离心管加入0．5ml[DNS，放入100℃水浴10rain，作为对照；另外3根离心管于4。℃水浴60rain后，加入0．5dDNS，放人100℃水浴10rain。3根管中均加入5rnl蒸馏水，4000r／rain离心10rain后，取上清液，于540nm测量OD，根据N一乙酰氨基葡萄糖的标准曲线计算出还原糖含量。酶活力单位(U／m1)表示在上述反应条件下，每分钟产生1μmol还原糖所需酶量。)（from：《淡紫拟青霉几丁质酶提取工艺的优化研究》）