微生物的生长和控制测定生长繁殖的方法

第七章微生物的生长及其控制生长和繁殖是保证微生物获得巨大数量的必要前提。生物个体物质有规律地、不可逆增加，导致个体体积扩大的生物学过程。生长（growth）：生物个体生长到一定阶段，通过特定方式产生新的生命个体，即引起生命个体数量增加的生物学过程。繁殖（reproduction）：生长是一个逐步发生的量变过程，繁殖是一个产生新的生命个体的质变过程。在高等生物里这两个过程可以明显分开，但在低等特别是在单细胞的生物里，由于细胞小，这两个过程是紧密联系又很难划分的过程。生长和繁殖群体生长=个体生长+个体繁殖个体生长→个体繁殖→群体生长在一定时间和条件下细胞数量的增加（微生物群体生长）微生物生长:在微生物学中提到的“生长”，一般均指群体生长，这一点与研究大生物时有所不同。第一节测定生长繁殖的方法单位时间里微生物数量或生物量（Biomass）的变化微生物生长：微生物生长的测定：个体计数群体重量测定群体生理指标测定评价培养条件、营养物质等对微生物生长的影响；评价不同的抗菌物质对微生物产生抑制(或杀死)作用的效果；客观地反映微生物生长的规律；一、测生长量测定生长量的方法很多，适用于一切微生物。（一）测生长量直接法（二）测生长量间接法（一）测生长量直接法测体积法：粗放型，在刻度离心管中测沉降量称干重法：精确型，离心法和过滤法获得菌体细胞，微生物的干重一般为其湿重的10％～20％。测定多细胞及丝状真菌生长情况的有效方法111.测体积：在刻度离心管中离心，测定沉淀多少来确定微生物的生长情况。2.测干重：将细胞培养液离心或过滤后，洗涤除去培养基成分后转移到适当的容器中，置100~105℃干燥箱烘干或低温低压干燥（60~80℃）至恒重后，称重。若是固体培养物，可先加热溶解琼脂，然后过滤出菌体，洗涤、干燥后再称重。该法适合于单细胞和多细胞微生物的生长测定。（二）测生长量间接法1.比浊法用分光光度法对无色的微生物悬浮液进行测定，一般选用450～650nm波段。实验测量时应控制在菌浓度与光密度成正比的线性范围内，否则不准确。在一定波长下，测定菌悬液的光密度，以光密度（opticaldensity,即O.D.）表示菌量。若要连续跟踪某一培养物的生长动态，可用带有侧臂的三角烧瓶作原位测定，即不必取样。2.生理指标法样品中微生物数量多或生长旺盛，这些指标愈明显，因此可以借助特定的仪器如瓦勃氏呼吸仪、微量量热计等设备来测定相应的指标。微生物的生理指标，如氮、碳、DNA、ATP等物质的含量，呼吸强度、耗氧量、酶活性、生物热等与其群体的规模成正相关。常用于对微生物的快速鉴定与检测一种特定的微生物，每一个细胞中的ATP浓度几乎是一个常数，所以测定这种微生物的ATP含量，即可知其细胞数。已知细胞数的微生物样品测定ATP含量测定未知细胞数的微生物样品的ATP含量换算出每个细胞所含的ATP量即可算出未知样中细胞数二、计繁殖数测定繁殖，一定要一一计算各个体的数目。单细胞状态的细菌和酵母菌放线菌和霉菌等丝状生长的微生物计算其孢子数计算细胞个体的数目link1（一）计繁殖数直接法（二）计繁殖数间接法（一）计繁殖数直接法1.计数板直接计数法指采用计数板（细菌计数板或血球计数板），在光学显微镜下直接观察微生物细胞并进行计数的方法。（计算一定容积里样品中微生物的数量）21采用血球计数板测定细胞个数22缺点：不能区分死菌与活菌；不适于对运动细菌的计数；需要相对高的细菌浓度；个体小的细菌在显微镜下难以观察；2.染色后活菌计数法采用特定的染色技术进行活菌染色，然后用光学显微镜计数的方法。可分别对活菌和死菌进行计数。例：美蓝酵母活细胞→无色死细胞→蓝色Eg.细菌经吖啶橙染色后，在紫外光显微镜下可观察活细胞→橙色荧光死细胞→绿色荧光将已知颗粒浓度的样品（例如血液）与待测细胞细胞浓度的样品混匀后在显微镜下根据二者之间的比例直接推算待测微生物细胞浓度。4.过滤计数法当样品中菌数很低时，可以将一定体积的湖水、海水或饮用水等样品通过膜过滤器。然后将滤膜干燥、染色，并经处理使膜透明，再在显微镜下计算膜上（或一定面积中）的细菌数。3.比例计数法（二）计繁殖数间接法是一种活菌计数法，这是一种依据活菌在液体培养基中会使其变混或在固体培养基上（内）形成菌落的原理而设计。最常用的是菌落计数法（colony-countingmethods）。1.平板菌落计数法可用浇注平板（pourplate）或涂布平板（spreadplate）等方法进行。此法适用于各种好氧菌或厌氧菌。采用培养平板计数法要求操作熟练、准确，否则难以得到正确的结果。样品充分混匀；每支移液管及涂布棒只能接触一个稀释度的菌液；同一稀释度三个以上重复,取平均值；每个平板上的菌落数目合适，便于准确计数；一个菌落可能是多个细胞一起形成，所以在科研中一般用菌落形成单位（colonyformingunits，CFU）来表示，而不是直接表示为细胞数。根据每皿上形成的CFU数乘上稀释度可推算出菌样的含菌数。此方法最为常用，但操作较繁琐且要求操作者技术熟练——缺点。国外出现了微型、快速、商品化的用于菌落计数的小型纸片或密封琼脂板。原理是利用加在培养基中的活菌指示剂TTC（2，3，5－氯化三苯基四氮唑），它可使菌落在很微小是就染成易于辨认的玫瑰色。2.膜过滤培养菌落计数法当样品中菌数很低时，可以将一定体积的湖水、海水或饮用水等样品通过膜过滤器，然后将将膜转到相应的培养基上进行培养，对形成的菌落进行统计。3.厌氧菌的菌落计数法一般可用亨盖特滚管培养法进行。此法设备较复杂，技术难度很高。简便快速的半固体深层琼脂法，可测定双歧杆菌（bifidobacteria）和乳酸菌（lacticacidbacteria）等厌氧菌活菌数。原理：试管中的深层半固体琼脂有良好的厌氧性能，并利用其凝固前可作稀释用，凝固后又可代替琼脂平板作菌落计数用的良好性能。兼有省工、省料、省设备和菌落易辩认等优点！