实验一-蛋白质的沉淀与凝固

1Ⅱ实验内容实验一蛋白质的沉淀与凝固蛋白质溶液是一稳定的亲水性溶胶液，其稳定的因素有二：一是蛋白质胶粒上的电荷使之相互排斥，不易凝集成团；二是胶粒表面的水化膜，它使胶粒与水融洽相依，又在胶粒之间起了隔离作用。如果上述两种稳定蛋白质溶液的因素被破坏，蛋白质将于溶液中沉淀析出。促使蛋白质沉淀的因素很多，大致可分为两类：第一类是可逆的沉淀反应。这时蛋白质的空间构象未受到很大改变，除去沉淀因素后，可以重新溶解，例如盐析和低温乙醇沉淀蛋白。第二类是不可逆的沉淀反应，重金属盐类或生物碱试剂沉淀蛋白后，由于蛋白质结构发生重大改变，所以不再溶于水中。不可逆的蛋白质沉淀多表示蛋白质已经变性。变性的蛋白质在等电点附近加热时，蛋白质分子间相互盘绕而变成坚实的凝块。一、蛋白质的盐析[原理]高浓度的盐离子可与蛋白质胶粒争夺水化膜，同时盐又是强电解质，可抑制蛋白质的解离。因而用高浓度的中性盐，使蛋白质带电量减少，水化膜破坏而从溶液中沉淀出来。盐析沉淀蛋白一般不引起蛋白变性，故常用于分离各种天然蛋白质。由于蛋白质的组成及性质不同，所以盐析时所需中性盐的浓度也不相同。例如半饱和的硫酸铵沉出球蛋白，饱和的硫酸铵则沉出清蛋白。[操作]1.取一试管，加入3ml5%蛋白质溶液及3ml饱和硫酸铵溶液，摇匀静止数分钟后观察现象。2.将试管内容物过滤，加硫酸铵粉末于滤液中，使达饱和状态，摇匀后观察现象。（注意固体硫酸铵若加到过饱和则有结晶析出，勿与蛋白质沉淀混淆。）3.取上项浑浊液1ml，加水2ml，观察是否复容。二.乙醇沉淀蛋白质[原理]乙醇是脱水剂，可与蛋白质争夺水化膜；此外，加入乙醇可使水的介电常数变小，蛋白质解离度降低，带电量减少。故加入乙醇能破坏蛋白质的胶体性质而使蛋白质沉淀。2用此法在低温下操作可使沉出的蛋白质保持其理化特性及其生物学活性，但室温中乙醇与蛋白质接触较久后，可使之变性，形成不可逆的沉淀。[操作]1.取试管4支，标出1、2、3、4号码，按下表操作试剂12345%蛋白质溶液（ml）111-1%乙酸（滴）-1-2--95%乙醇（ml）---22.将3管及4管置冰水中，放置5分钟，然后将第4管的冰乙醇倒入第3管中（此步最好在冰水中进行），混匀，同时向第1及第2管中各加入未冰浴的乙醇2ml混匀，观察各管的沉淀情况并立即向第1、2及3管中各加入蒸馏水10ml，混匀，比较各管变化并解释之。三.重金属盐沉淀蛋白[原理]在溶液的PH值大于蛋白质的等电点时，带负电荷的蛋白质与重金属离子（Ca2+、Hg2+、Ag1+、Pb2+等）结合成盐而沉淀。[操作]取试管4支，按下表操作。试剂（滴）12345%蛋白质溶液55551%乙酸--101010g/L硫酸铜3-3-30g/L硝酸银-3-3混合均匀，比较各管浑浊程度并解释之。四.生物碱试剂沉淀蛋白[原理]能沉淀生物碱（或植物碱）或与其产生颜色反应的物质称为生物碱试剂，如鞣酸、苦味酸、磷钨酸等。在溶液的PH值小于蛋白质的等电点时，带正电荷的蛋白质与生物碱试剂的负离子结合成盐而沉淀。3[操作]取试管3支，按下表操作。试剂1235%蛋白质溶液（ml）1111%乙酸（滴）101010苦味酸溶液（滴）数滴--鞣酸溶液（滴）-数滴-三氯乙酸溶液（滴）--数滴混合均匀，比较各管浑浊程度并解释之。五.蛋白质的加热凝固[原理]蛋白质在其等电点附近加热，即发生变性凝固，在加热过程中，随着蛋白质变性作用的深化，使已变性的蛋白质分子间凝聚成凝胶状的蛋白块。但应注意，当蛋白质溶液远离等电点而带有很多同种电荷时，加热虽可使其变性，但因同种电荷的排斥作用并不发生凝固现象。[操作]取试管4支，按下表操作试剂12345%蛋白质溶液（ml）22221%乙酸（滴）-1-2--10%乙酸（ml）--0.5-100g/LNaOH（ml）---0.5混匀后各管分别加热，观察有否沉淀析出及沉淀析出的多少、快慢并解释之。。另外在第2管加热蛋白沉出后再加入5ml蒸馏水，观察是否复溶，为什麽？[试剂]1．5%蛋白溶液：取出鸡蛋清用蒸馏水稀释5倍，搅匀后用纱布过滤。2．饱和硫酸铵溶液。3．硫酸铵结晶粉末。4．95%乙醇。5．1%乙酸和10%乙酸。46．30g/L硝酸银溶液。7．10g/L硫酸铜溶液。8．100g/L氢氧化钠溶液。9．苦味酸饱和溶液及鞣酸饱和溶液。10．100g/L三氯乙酸溶液。（李素婷）5实验三微量凯氏定氮法[原理]蛋白质样品与浓硫酸共热时，分解出氮、二氧化碳和水，而氮转变为氨，氨与硫酸结合生成硫酸铵，再与纳氏试剂显色，与标准液比较，可求其含氮量。如测血清蛋白，可将总氮量减去非蛋白氮量，再乘以6.25即得蛋白质量。[操作]1．取血清或血浆0.2ml，以0.9%NaCl溶液稀释至10ml（稀释50倍）2．取消化管1支，加入稀释血清0.5ml，50%硫酸0.5ml,玻璃珠1枚，在电炉上消化。3．当出现白雾并充满消化管时，消化管口加玻盖，再继续消化3分钟左右，冷却，加3%H2O21~2滴，再消化至出现白雾，加盖，继续消化至无色透明，完全冷却后加蒸馏水至17.5ml，再加纳氏试剂至25ml，混匀，与标准管比色。4．标准管制备：取硫酸铵标准液（应用液）制备标准曲线，以蒸馏水作空白调零，500nm波长比色。5．标准曲线制备：取硫酸铵标准液（应用液）制备标准曲线，取5支干净试管操作如下试剂（ml）12345标准硫酸铵应用液-0.81.21.62.018NH2SO40.10.10.10.10.1蒸馏水3.42.62.21.81.4混匀，各管加奈氏试剂1.5ml,以第1管为空白，用500nm波长比色得各管光密度值，以浓度为横坐标，测得各管光密度为纵坐标，作一标准曲线。6．测得测定管的光密度值，于标准曲线上查出含氮量。[计算]蛋白质g%=含氮量6.25100[试剂]1．50%硫酸2.18N硫酸溶液：取比重1.84的分析纯浓硫酸50毫升慢慢加到50毫升蒸馏水中。3.3%H2O24.0.9%NaCl5.奈氏试剂：6奈氏试剂贮存液：于500毫升锥形瓶内加入碘化钾150克，碘110克及蒸馏水100毫升和纯汞150克，振摇到碘色将变时（约15分钟），混合液发生高热，将锥型瓶放入冷水内继续振摇至棕红色的碘转变成带绿色的碘化钾汞溶液时为止。将上清液倾入2000毫升的量筒中，用蒸馏水洗涤瓶内壁及瓶内沉淀物数次，将洗液一并倾入量筒中，加蒸馏水至2000毫升。奈氏试剂应用液：取10%氢氧化钠溶液700毫升，加入奈氏贮存液150毫升，摇匀，用蒸馏水稀释到1000毫升。如浑浊，可静止过夜，取上请液备用。6．硫酸胺标准贮存液：（1毫升=1毫克氮）取分析纯硫酸铵置烤箱中110oC，干燥半小时，取出置干燥器内待其冷却，准确称取干燥的硫酸铵4.716克，置1000毫升量瓶中，加蒸馏水300毫升使之溶解，加纯浓硫酸1毫升，再加蒸馏水至刻度。(NH4)2SO4分子量132.06；其氮占28。故：132.06﹕28=4.716﹕XX=1即4.716克硫酸铵中含氮1克7．硫酸铵标准应用液：取硫酸铵标准贮存液1.0毫升，于100毫升容量瓶中，加纯硫酸0.1毫升，以蒸馏水稀释至刻度，于带磨口玻璃瓶中保存。（周晓慧）7实验四双缩尿法测定蛋白质含量[原理]凡含有两个以上肽键的化合物在碱性溶液中能与硫酸铜作用生成紫色或紫红色的复合物，这一反应称为双缩尿反应。蛋白质含有肽键，因而一切蛋白质均可与双缩尿试剂发生颜色反应，且颜色的深浅与蛋白质浓度成正比，经与同样处理的标准蛋白溶液相比，即可求出样品中的蛋白质含量。[操作]1.标准曲线的制备取6支试管按下表配成不同浓度的标准蛋白液试剂123456标准蛋白溶液（10mg/ml）0.00.10.30.50.70.9生理盐水（ml）1.00.90.70.50.30.1双缩脲试剂(ml)4.04.04.04.04.04.0蛋白浓度(mg/ml)0.00.20.61.01.41.8混匀后，于37℃水浴中保温15分钟，在520nm波长下比色，以第一管调零，测得各管的光密度。以各管的光密度值为纵坐标，以蛋白质浓度为横坐标，绘制标准曲线。2.样品测定取待测蛋白样品0.1ml，加生理盐水0.9ml，再加双缩脲试剂4.0ml，于37℃水浴中保温15分钟，测其光密度，查标准曲线即可得出样品中的蛋白质含量。[试剂]1．10g/L标准蛋白溶液：准确称取经凯式定氮法校正的结晶牛血清蛋白或人血清蛋白10g，用生理盐水配成浓度为10mg/ml。2．双缩尿试剂：称取CuSO4•5H2O2.5g、蒸馏水100ml加热助溶。另取酒石酸钾钠10g、碘化钾5g，溶于500毫升蒸馏水中，再加200g/LNaOH300ml混合，然后将硫酸铜溶液倾入，加蒸馏水至1000ml。3.生理盐水（周晓慧）8实验五改良酚试剂法测定蛋白质含量[原理]蛋白质中所含酪氨酸和色氨酸等残基能在碱性条件下与酚试剂之磷钼酸、磷钨酸作用产生蓝色化合物，其颜色深浅与蛋白质含量成正比。利用蓝色深浅与蛋白质浓度成正比的关系可绘制标准曲线，测定样品中蛋白质含量。[操作]（一）制作标准曲线1．取试管6支分别编号，按下表加入试剂：试剂（ml）123456标准蛋白溶液（1mg/ml）0.00.20.40.60.81.0生理盐水1.00.80.60.40.20.0试剂A0.90.90.90.90.90.9混匀后置于50C水浴10分钟，冷却后各管加入试剂B0.1ml，室温放置10分钟，各管加入试剂C3ml，立即混匀，置37C水浴箱恒温10分钟。冷却后以1号管为空白，在分光光度计上以波长650nm比色，读取光密度值。2.以各标准样品蛋白质浓度为横坐标，各管光密度值为纵坐标作标准曲线。（二）样品测定取试管2支，按下表加入试剂试剂（ml）测定管空白管稀释的待测样品1.0-生理盐水-1.0试剂A0.90.9混匀后在50C水浴箱中保温10分钟，取出冷却后，两管各加试剂B0.1ml，室温放置10分钟，再各加试剂C3ml，立即混匀，置37C水浴箱保温10分钟，冷却后在分光光度计上以波长650nm比色读取光密度值。[结果与计算]根据测定管光密度值查标准曲线，由标准曲线计算样品蛋白质含量。[注意事项]1.测定蛋白质的浓度应在0.015～0.110mg/ml范围。2.各管加酚试剂必须快速，并立即摇匀，不应出现混浊。9[试剂]1.标准蛋白溶液：称量干燥的人血清白蛋白（BSA）或丙种球蛋白10mg，用生理盐水配制成1mg/ml的标准蛋白溶液。2．试剂A：2g酒石酸钾钠及100gNa2CO3溶于500ml1mol/LNaOH中，用蒸馏水稀至1000ml。3．试剂B：2g酒石酸钾钠及1gCuSO45H2O分别溶解于少量水中，混合后加蒸馏水至90ml，再加10ml1mol/LNaOH即成。4．试剂C：（1）市售的酚试剂，用1mol/LNaOH滴定相当于2.5mol/LHCl，按1﹕10稀释即可。（2）称取Na2WO42H2O100g及Na2MoO42H2O25g溶于700ml蒸馏水中，加入85%H3PO450ml，浓HCl100ml混匀后，置圆底烧瓶中回流10小时，加入硫酸锂（Li2SO4H2O）150g、蒸馏水50ml及浓溴水数滴，继续煮沸15分钟去溴，冷却后稀释至1000ml，过滤，溶液应为金黄色，置棕色瓶中保存，使用时稀释至1mol/L。（周晓慧）10实验六紫外分光光度法测定蛋白质含量[原理]蛋白质在280nm处的特征性吸收峰，是由于其中所含有的芳香族氨基酸：酪氨酸、色氨酸、苯丙氨酸所引起的，其光密度和蛋白质的浓度呈线性关系，可用于蛋白质的定量。对于同样浓度的不同蛋白质，如果酪氨酸、色氨酸及苯丙氨酸含量不同，其光密度值也不同，选用标准蛋白质时必须注意。若样品中含有其它具有紫外吸收的杂质，如核酸、核苷酸等，可产生较大的误差，故应作适当的校正。蛋白质样品中含有核酸时，混杂的核酸在280nm处也有吸收，对此法有一定的影响。因此，一般情况下在测定A280的同时，测定A260，计算A280/A260的比值。如果A280/A260≥1.5，可忽略不计核酸的影响，A280/A26