专题2--微生物培养与应用

一、微生物在现代生物技术中有哪些应用？1.提取工具酶：2.提供运载体：3.作为受体细胞：4.提供目的基因：5.构建基因文库：6.发酵工程的工程菌：限制性核酸内切酶、DNA连接酶等细菌质粒、λ噬菌体、动植物病毒等培养转基因微生物抗虫基因、抗病基因等直接分离目的基因构建基因组文库、逆转录构建cDNA文库生产味精的谷氨酸棒状杆菌、生产酸奶的乳酸杆菌等㈠培养基P2841.五大基本成分：各种培养基一般都含有碳源、氮源、生长因子、水和无机盐，此外还要满足微生物生长对pH、特殊营养物质以及氧气的要求。1、提供微生物生长繁殖所需营养和环境条件2、确保其它微生物无法混入二、实验室培养微生物条件——培养基——无菌技术氧元素、氢元素H2O无机盐NaCl碳源、氮源、维生素蛋白胨碳源、氮源、磷酸盐、维生素牛肉膏提供的主要营养培养基组分培养细菌常用的培养基——牛肉膏蛋白胨培养基②按物理状态不同划分固体培养基液体培养基半固体培养基①按化学组成不同划分：合成培养基/天然培养基2.培养基的种类扩大培养、工业生产含琼脂，用于菌落鉴定、分离和计数观察微生物运动、保存菌种固体培养基：观察菌落、鉴定、分离和计数划线法、稀释涂布分离法半固体培养基：无动力有动力(弥散)观察微生物运动、保存菌种液体培养基表面生长均匀混浊生长沉淀生长③按用途不同划分鉴别培养基选择培养基可在培养基中加入某种化学物质，以抑制不需要的微生物的生长，促进所需要的微生物的生长。鉴别培养基是根据微生物的代谢特点，在培养基中加入某种指示剂或化学药品配制而成的，用以鉴别不同种类的微生物。鉴别培养基鉴别培养基是根据微生物的代谢特点，在培养基中加入某种指示剂或化学药品配制而成的，用以鉴别不同种类的微生物。在培养基中加入伊红和美蓝，可以用来鉴别饮用水和乳制品中是否存在大肠杆菌等细菌：如果有大肠杆菌，其代谢产物就与伊红和美蓝结合，使菌落呈深紫色，并带有金属光泽。大肠杆菌在伊红美兰培养基上生长利用拓印法选择出缺少抗氨苄青霉素能力的工程菌。培养基中加氨苄青霉素具有抗氨苄青霉素能力的菌落选择出没有抗氨苄青霉素能力的工程菌没有抗氨苄青霉素能力的菌落被淘汰选择培养基以下选择培养基可以分离哪些微生物？•加入青霉素的培养基杀死细菌、放线菌，分离酵母菌、霉菌等真菌•加入高浓度食盐的培养基杀死多种微生物，分离出金黄色葡萄球菌•不加氮源的无氮培养基分离出自生固氮菌（非固氮菌因缺少氮源被淘汰）•不加含碳有机物的无碳培养基分离出自养型微生物（异养微生物因缺少有机物被淘汰）•加入抗生素的培养基利用抗生素抗性基因作标记基因，选择分离出导入目的基因的工程菌分解纤维素的微生物的分离（1）实验原理纤维素+染料→红色复合物（纤维素+）+刚果红染料→培养基中出现以纤维素分解菌为中心的刚果红纤维素酶透明圈（2）实验流程土壤取样制备选择培养↓挑选产生透明圈的菌落将样品涂布到鉴别的培养基上纤维素分解菌梯度稀释不同菌落的透明圈大小不同可以说明什么问题？分解纤维素的微生物的分离透明圈的应用（1）筛选具有某种特定功能（如分泌某种酶）的微生物（目的菌）（2）基因工程中表达载体的构建、目的基因的检测与鉴定（3）细菌抗药性的筛选不同菌落的透明圈大小不同可以说明微生物体分解纤维素酶能力的大小。例：通过选择培养基可以从混杂的微生物群体中分离出所需的微生物。在缺乏氮源的培养基上大部分微生物无法生长；在培养基中加入青霉素可以抑制细菌和放线菌；在培养基中加入10%酚可以抑制细菌和霉菌。利用上述方法能从混杂的微生物群体中分别分离出A.大肠杆菌B.霉菌（）C.放线菌D.固氮细菌多选DBC（二）无菌技术1、实验室常用的消毒和灭菌方法：⑴消毒：使用较为温和的物理或化学方法杀死物体表面或内部的部分微生物（不包括芽孢和孢子）。煮沸法：100℃5-6min杀死微生物细胞和部分芽孢巴氏消毒法：70-75℃煮30min，杀死牛奶中微生物化学药剂消毒法：酒精、氯气（2）灼烧灭菌——如接种环等：接种时，用于接种工具或其他金属用具灭菌。直接在酒精灯火焰的充分燃烧层灼烧可以迅速彻底灭菌（3）干热灭菌：用于耐高温需干燥物品（玻璃器皿、金属用具）（4）高压蒸汽灭菌——培养基：用于培养基等物品的灭菌2、无菌操作：操作空间、操作者、培养器皿、接种用具、培养基讨论：1.为什么在实验过程要使用无菌技术？2.请你判断以下材料或用具是否需要消毒或灭菌。如果需要，请选择合适的方法。（1）培养细菌用的培养基与培养皿（2）玻棒、试管、烧瓶和吸管（3）实验操作者的双手⑴防止实验室的培养物被其他外来微生物污染；⑵避免操作者自身被微生物感染。（1）、（2）需要灭菌；（3）需要消毒。三、纯化实验操作（一）制备牛肉膏蛋白胨固体培养基1、计算2、称量3、溶化4、灭菌5、倒平板倒平板注意事项：①温度：50℃左右②操作在酒精灯火焰周围③冷凝后平板倒置讨论1.平板冷凝后，为什么要将平板倒置？答：平板冷凝后，皿盖上会凝结水珠，凝固后的培养基表面的湿度也比较高，将平板倒置，既可以使培养基表面的水分更好地挥发，又可以防止皿盖上的水珠落入培养基，造成污染。(二）纯化大肠杆菌⑴平板划线法:通过接种环在琼脂固体培养基表面连续划线的操作,将聚集的菌种逐步稀释分散到培养基的表面.在数次划线后,可以分离到由一个细胞繁殖而来的肉眼可见的子细胞群体,这就是菌落.微生物的接种技术划线后，线条末端细菌的数目比线条起始处要少，每次从上一次划线的末端开始，能使细菌的数目随着划线次数的增加而逐步减少，最终能得到由单个细菌繁殖而来的菌落。单菌落1.为什么在操作的第一步以及每次划线之前都要灼烧接种环？在划线操作结束时，仍然需要灼烧接种环吗？为什么？答：操作的第一步灼烧接种环是为了避免接种环上可能存在的微生物污染培养物；每次划线前灼烧接种环是为了杀死上次划线结束后，接种环上残留的菌种，使下一次划线时，接种环上的菌种直接来源于上次划线的末端，从而通过划线次数的增加，使每次划线时菌种的数目逐渐减少，以便得到菌落。划线结束后灼烧接种环，能及时杀死接种环上残留的菌种，避免细菌污染环境和感染操作者。讨论2.在灼烧接种环之后，为什么要等其冷却后再进行划线？答：以免接种环温度太高，杀死菌种。3.在作第二次以及其后的划线操作时，为什么总是从上一次划线的末端开始划线？答：划线后，线条末端细菌的数目比线条起始处要少，每次从上一次划线的末端开始，能使细菌的数目随着划线次数的增加而逐步减少，最终能得到由单个细菌繁殖而来的菌落。讨论⑵稀释涂布平板法（稀释度和稀释浓度）稀释涂布平板法则是将菌液进行一系列的梯度稀释，然后将不同稀释程度的菌液分别涂布到固体培养基的表面，进行培养，以形成标准菌落。接种后的培养基和一个未接种的培养基(空白对照）都放入37恒温箱中，培养12h和24h后，分别观察并记录结果（三）微生物数量测定1、测定土壤中的细菌数，一般选用104、105、106倍的稀释液进行平板培养。实验时，每一浓度至少涂布3个平板，以增强实验的说服力和准确性。当样品的稀释度足够高时，培养基表面生长的菌落来源于样品稀释液中的一个活菌，通过统计平板上的菌落数，就能推测出样品大约含有多少个活菌。（2）计数规则①计算方法：每克样品中的菌落数=（C÷V）×MC代表某一稀释度下平板上生长的平均菌落数V代表涂布平板时所用稀释液的体积（mL）M代表稀释倍数②设置对照：排除实验组中非测试因素对实验结果的影响，提高实验结果的可信度。选择菌落数在30～300的平板进行计数若某两个或多个稀释浓度下获得的菌落数均符合条件时，要看两者菌落数的比值，若小于2，则取两者的平均值；若大于2，则取较小值1.关微生物营养物质的叙述中，正确的是A.是碳源的物质不可能同时是氮源B.凡碳源都提供能量C.除水以外的无机物只提供无机盐D.无机氮源也能提供能量D硝化细菌氧化氨获得化学能NaNO3提供氮源CO2不能提供能量蛋白质既是碳源也是氮源。3.09（安徽）下列是关于“检测土壤中细菌总数”实验操作的叙述，其中错误的是A.用蒸馏水配制牛肉膏蛋白膝培养基，经高温、高压灭菌后倒平板B.取104、105、106倍的土壤稀释液和无菌水各0.1ml，分别涂布于各组平板上C．将实验组和对照组平板倒置，370C恒温培养24-48小时D．确定对照组无菌后，选择菌落数在300以上的实验组平板进行计数D应该选择菌落数在30—300的平板进行计数4.09（重庆）下列有关大肠杆菌的叙述，正确的是A.大肠杆菌以复制方式进行繁殖，其拟核是一个环状DNA分子B.在含葡萄糖和乳糖的培养基上，大肠杆菌首先利用乳糖作碳源C.用大肠杆菌工程菌生产干扰素时．应及时添加核酸等生长因子D.处于对数期（生长快、繁殖快时期）的大肠杆菌．常作为生产用的菌种和科研的材料D应该添加氨基酸5.宁夏09（15分）（1）在大肠杆菌培养过程中，除考虑营养条件外，还要考虑______、______和渗透压等条件。由于该细菌具有体积小、结构简单、变异类型容易选择、______、______等优点，因此常作为遗传学研究的实验材料。（2）在微生物培养操作过程中，为防止杂菌污染，需对培养基和培养皿进行________（消毒、灭菌）；操作者的双手需要进行清洗和______；静止空气中的细菌可用紫外线杀灭，其原因是紫外线能使蛋白质变性，还能__________。（3）若用稀释涂布平板法计数大肠杆菌活菌的个数，要想使所得估计值更接近实际值，除应严格操作、多次重复外，还应保证待测样品稀释的_______。生活周期短温度酸碱度易培养灭菌消毒损伤DNA结构比例合适（4）通常，对获得的纯菌种还可以依据菌落的形状、大小等菌落特征对细菌进行初步的____________。（5）培养大肠杆菌时，在接种前需要检测培养基是否被污染。对于固体培养基应采用的检测方法是（6）若用大肠杆菌进行实验，使用过的培养基及其培养物必须经过_______处理后才能丢弃，以防止培养物的扩散。鉴定将未接种的培养基在适宜的温度下放置适宜的时间,观察培养基上是否有菌落产生。灭菌6.09（10分）（全国理综2）利用微生物分解玉米淀粉生产糖浆，具有广阔的应用前景。但现有野生菌株对淀粉的转化效率低，某同学尝试对其进行改造，以获得高效菌株。（1）实验步骤：①配置________（固体、半固体、液体）培养基，该培养基的碳源应为________。②将_____________接入已灭菌的培养基平板上。③立即用适当剂量的紫外线照射，其目的是___________________。固体玉米淀粉野生菌株对野生菌株进行诱变④菌落形成后，加入碘液，观察菌落周围培养基的颜色变化和变化范围的大小。周围出现_______________现象的菌落即为初选菌落，经分离、纯化后即可达到实验目的。（2）若已得到二株变异菌株I和II，其淀粉转化率较高，经测定菌株I淀粉酶的催化活性高，菌株II的淀粉酶蛋白含量高，经进一步研究发现，突变发生在淀粉酶基因的编码区或非编码区，可推测出菌株I的突变发生在________区，菌株II的突变发生在_________区。（透明圈）浅色范围大编码非编码表达的蛋白质多。产生高效酶的基因7.右表是某微生物培养基成分，请据此回答：（1）右表培养基可培养的微生物类型是：（2）若不慎将过量NaCl加入培养基中。如不想浪费此培养基，可再加入：编号成分含量①粉状硫10g②（NH4）2SO40.4g③K2HPO44.0g④MgSO49.25g⑤FeSO40.5g⑥CaCl20.5g⑦H2O100ml自养型微生物含碳有机物编号成分含量①粉状硫10g②（NH4）2SO40.4g③K2HPO44.0g④MgSO49.25g⑤FeSO40.5g⑥CaCl20.5g⑦H2O100ml⑶若除去成分②，加入（CH2O），该培养基可用于培养。⑷表中营养成分共有类⑸不论何种培养基，在各种成分都溶化后分装前，要进行的是。固氮微生物3调整pH编号成分含量①粉状硫10g②（NH4）2SO40.4g③K2HPO44.0g④MgSO49.25g⑤FeSO40.5g⑥CaCl20.5g⑦