Western-Blotting(半干转)-超级详细步骤

1WesternBlottingAnalysisGuide（半干转）Westernblotting(半干转)可分为以下9个步骤：一、蛋白的提取A．总蛋白提取1.将收集的细胞或组织(约0.1g)从-80°C冰箱取出，按1:10(w:v)加入冰浴的蛋白裂解液(RIPA)；并加入1/10体积的蛋白酶抑制剂（PMSF）2.用Dounce手动匀浆器或电动匀浆器，匀浆细胞或组织（注意：全程冰上操作，每个样品用Dounce上下抽动相同的次数，电动匀浆器匀浆相同的转速及时间）3.冰上静置20min后，12000rpm离心，4°C，15min，取上清。B．核蛋白提取1.称取100mg肝脏冰冻组织置于Dounce手动匀浆器，加入1mL冰浴的核蛋白裂解液A，上下抽动5下（注意：全程冰上操作，不同组织上下抽动需摸条件，匀浆后能看到些许小组织块）2.将匀浆液倒入1.5mL离心管，瞬时离心30s3.上清倒入另一1.5mL离心管，冰浴5min4.3000rpm离心，4°C，10min，上清倒入另一1.5mL离心管收集（此为胞浆蛋白）5.沉淀加入50μL核蛋白裂解液B吹打，冰浴20min6.12000rpm离心，4°C，20min，将上清吸入0.5mL离心管收集（此为核蛋白）。二、蛋白浓度的测定在碱性条件下，BCA与蛋白质结合时，蛋白质将Cu2+还原为Cu+，一个Cu+螯合二个BCA分子，工作试剂由原来的苹果绿形成紫色复合物，最大光吸收强度与蛋白质浓度成正比。1．BCA标准品和样品的准备：（BCA标准品为5mg/mL）配制1mg/mL的标准品：取10μL原标准品+40μLPBS缓冲液混匀，浓度为1mg/mL配制0.25mg/mL的标准品：取5μL上述1mg/mL的标准品+15μLPBS缓冲液混匀，浓度为0.25mg/mL样品用水以1–5倍稀释，并且将蛋白裂解液用PBS缓冲液按相同的比例稀释作为样品的空白对照（建议样品稀释2倍，不同组织使用不同稀释倍数）。2．配制工作液：根据标准品和样品数量，按试剂A:B=50:1配制适量BCA工作液，充分混匀（注意：BCA2工作液室温24h内稳定）。3．标曲制作与样品测定：按下表比例加入96孔蛋白测定板：0.25mg/mL的标准品1mg/mL的标准品终浓度031.2562.51252505001000试剂/编号①②③④⑤⑥⑦BCA标准品，μL02.552.551020PBS，μL2017.51517.515100工作液，μL200200200200200200200样品测定：2μL样品+18μLPBS缓冲液+200μL工作液（可做3个重复）；蛋白裂解液用水按相同的比例稀释作为样品的空白对照37°C孵育30min，酶标仪OD595nm测定吸光度；根据标曲和样品吸光度计算出样品相应的蛋白浓度；将蛋白统一用蛋白裂解液稀释至合适的浓度（注意：蛋白冰上操作），-80°C冰箱存放（但存放不久，按蛋白上样比例加入1×loadingbuffer，再95℃变性5min，-80°C保存，会比较久）。三、样品的前处理蛋白变性是破环蛋白的三级结构，使抗体识别的抗原表位暴露出来。SDS作用：结合蛋白可以使蛋白表面带满负电荷，使电泳可以顺利进行。因此，SDS的质量非常重要，需要新鲜的。DTT作用：强变性剂，减少蛋白二硫键。甘油：助沉剂，使蛋白能维持在胶孔上方。上样体系准备：V样品:V1×loadingbuffer=3:1，振荡混匀离心后，95-100°C水浴5min，若是跨膜蛋白70°C水浴5-10min，变性前后都需要震荡混匀（4×loadingbuffer用PBS液稀释至1×，可适当增加1×的浓度，方便上样，但不可太大）注意：如果是做蛋白质相互作用，需做变性胶，参照如下:ProteinStateGelconditionLoadingbufferMigrationbufferReduced-DenaturedReducing&DenaturingWithβ-mercaptoethanolorDTTandSDSWithSDSReduced-NativeReducing&Non-DenaturingWithβ-mercaptoethanolorDTT,noSDSNoSDSOxidized-DenaturedNon-Reducing&DenaturingNoβ-mercaptoethanolorDTT,withSDSWithSDS3Oxidized-NativeNon-reducing&NativeNoβ-mercaptoethanolorDTT,noSDSNoSDS四、SDS-PAGE电泳1.清洗玻璃板：一只手扣紧玻璃板，另一只手蘸点洗衣粉轻轻擦洗。两面都擦洗过后用自来水冲，再用蒸馏水冲洗干净后立在筐里晾干。2.配胶配方参照附。该过程戴手套，TEMED等具有神经毒。3.灌胶A．玻璃板对齐后放入夹中卡紧。然后垂直卡在架子上准备灌胶（操作时要使两玻璃对齐，以免漏胶，小玻板在外，大玻板在内）B．分离胶及浓缩胶均可事先配好（除AP现配现用；TEMED促凝最后添加外），过滤后作为储存液避光存放于4°C，可至少存放1个月，临用前取出室温平衡（否则凝胶过程产生的热量会使低温时溶解于储存液中的气体析出而导致气泡，有条件者可真空抽吸3分钟），加入10%AP（0.7~0.8:100，分离胶浓度越高AP浓度越低，15%的分离胶可用到0.5:100）及TEMED（分离胶用0.4:1000，15%的可用到0.3:1000，浓缩胶用0.8：1000）摇匀即可灌胶。灌胶时可用10mL枪吸取5mL胶沿玻璃放出，待胶面升到绿带中间线高度时即可。（灌胶时开始可快一些，胶面快到所需高度时要放慢速度；操作时胶一定要沿玻璃板流下，这样胶中才不会有气泡）C．灌入2/3的分离胶后应立即封胶，胶上加一层甲醇，液封后的胶凝的更快。当甲醇和胶之间有一条折射线时，说明胶已凝了。再等3min使胶充分凝固就可倒去胶上层甲醇并用吸水纸将其吸干D．按前面方法配4％的浓缩胶，加入TEMED后立即摇匀即可灌胶。将剩余空间灌满浓缩胶然后将梳子插入浓缩胶中（灌胶时也要使胶沿玻璃板流下以免胶中有气泡产生；插梳子时要使梳子保持水平；由于胶凝固时体积会收缩减小，从而使加样孔的上样体积减小，所以在浓缩胶凝固的过程中要经常在两边补胶）E.待到浓缩胶凝固后（约1h），将玻板取下，用ddH2O冲洗掉玻板上溢出的胶，并将冲洗后的浓缩胶放入电泳槽中。（小玻璃板面向内，大玻璃板面向外；若只跑一块胶，那槽另一边要垫一块塑料板且有字的一面向外）F.两手分别捏住梳子的两边竖直向上轻轻将其拔出，并将电泳槽放入大槽中卡稳。并注入1×runningbuffer，注满整个电泳槽(若上样孔有变形，可用适当粗细的针头拨正；若变形严重，可在去除残胶后用较薄的梳子再次插入梳孔后加水拔出）G．30min后即可上样。（长时间有利于胶结构的形成，因为肉眼观的胶凝时其内部分4子的排列尚未完成）4.上样A．测完蛋白含量后，计算含50μg蛋白的溶液体积即为上样量。取出经计算后的合适体积的样品至PCR离心管中，按体积比V样品:V1×loadingbuffer=3:1准备样品，振荡混匀离心后，95-100°C水浴5min，若是跨膜蛋白70°C水浴5-10min，变性前后都需要震荡混匀（上样总体积一般不超过15μL，加样孔的最大限度可加20μL样品；变性可在PCR仪器上，95°C变性5min）B．加足够的电泳液后开始准备上样。用微量进样器贴壁吸取样品，将样品吸出不要吸进气泡。将加样器针头插至加样孔中缓慢加入样品。（电泳液至少要漫过内测的小玻璃板；加样太快可使样品冲出加样孔，若有气泡也可能使样品溢出；加入下一个样品时，进样器需在外槽电泳缓冲液中洗涤3次，以免交叉污染）5.电泳先稳压80V15-20min，等蛋白marker开始分离，将电压调至120V，等loading或溴酚兰刚刚跑出胶，即结束电泳。若只需SDS-PAGE，到此已结束，然后可用考马斯亮蓝或银染查看蛋白情况（点样时，每块板Marker上再点5μL4×SDSsamplebuffer，最边上样品旁的孔内也5μL4×SDSsamplebuffer，消除边缘效应）。五、PAGE胶转印转印前准备：在电泳结束前30分钟应开始准备工作在电泳过程中，提前准备转印所需物品：根据转印所用胶的大小，剪一稍比胶大一些的厚滤纸和一刚好大小的厚滤纸（比如：如果有四块胶，每块所需大小为5cm×2cm，则所需最下面的滤纸大小为5.5cm×8.5cm，最上面的滤纸大小为5cm×8cm），将此两张膜浸入电转印液中(80mL电泳液和20mL的甲醇混合液)；再剪四张大小为5cm×2cm的PVDF膜，左下角剪去一角，将此膜浸泡在甲醇溶液中不超过1min后取出浸入ddH2O中1min，取出浸入转印液中（切滤纸和膜时一定要戴手套，因为手上的蛋白会污染膜）（如果是NC膜，则用镊子捏住膜的一边轻轻置于有超纯水的平皿里，要使膜浮于水上，只有下层才与水接触。这样由于毛细管作用可使整个膜浸湿。若膜沉入水里，膜与水之间形成一层空气膜，这样会阻止膜吸水，靠毛细作用自然吸水后再完全浸入水中10min以排除气泡，随后浸泡入转移液中）取胶与夹板制作：从转印液中取出5.5cm×8.5cm的厚滤纸整齐的平铺于电转槽的正中，将浸泡于转印液中的四张大小为5cm×2cm的PVDF膜平铺于厚滤纸上，注意和滤纸间不要有气泡，再倒一些transferbuffer到膜上，保持膜的湿润；用翘板（绿色）从胶板（厚板在下，薄板在上）底部轻轻撬起薄板（撬时一定要小心，玻板很易裂），用平衡液润湿胶面，根据Marker的位置以及所需蛋白分子量切下大小为5cm×2cm的胶，将胶按照顺序依次平移至滤纸上；再在胶上5铺上事先浸泡于转印液中的5cm×8cm的厚滤纸；一手压住滤纸一端，一手用玻璃棒在滤纸上轻轻滚动以擀走膜、胶以及滤纸之间的空气。(铺胶时，有Marker的一端与剪掉一角的PVDF膜一致；膜和胶以及滤纸铺好以后切勿再移动，为防止膜上的电转液过少或者在擀空气时流失，可在擀完空气后倒一些电转液在膜上)转印：A.三明治夹板制作好后，盖上电转槽盖，一般20V转移40min。B.转完后如果想检测一下蛋白转印情况，可将膜用1×丽春红染液染5min（于脱色摇床上摇）。然后用水冲洗掉没染上的染液就可看到膜上的蛋白，将膜晾干备用。转印条件：1×transferingbuffer配方参照附。注意：对于蛋白分子量100kD的蛋白a.在转印液中加入终浓度为0.1%SDS；b.将转印液甲醇终浓度降低为10%或更低；c.用半干转印放，4°C过夜对于蛋白分子量100kD的蛋白a.在转印液中不加SDS；b.将转印液甲醇终浓度保持在20%整个过程必须戴手套，防止污染了转印膜及其他物品。六、封闭转印结束，将膜从电转槽中取出，TBST稍加漂洗3次，每次5-10min；尔后浸没于封闭液中缓慢摇荡1h。(必要时可先用丽春红染色（2%乙酸，0.5%丽春红的水溶液）观察蛋白条带，再用去离子水和TTBS将丽春红洗脱后封闭，如用蛋白marker则可省略此步)封闭是将转印膜上坑坑洼洼的地方用BSA或脱脂奶粉填平，降低抗体的非特异性吸附产生很浓的背景。常用5%BSA和脱脂奶封闭，若是做磷酸化蛋白，只能用BSA，因为，奶中含有磷酸化蛋白。而封闭液浓度，可根据实验需摸索条件。蛋白面朝上，封闭2h，摇床速度不超过40，结束后直接进一抗。七、一抗孵育抗体按照说明书浓度用1×TBST稀释，稀释液中可加与封闭同浓度的BSA或脱脂奶，也可加0.25-0.5%BSA或脱脂奶，甚至不加。根据实际情况，背景重杂带多，则多加；背景少杂带少，可少加。（5mlBSA中加入5μL抗体，1：1000稀释）黏在rotater上，4°C孵育过夜。第二天，用1×TBST洗3次，每次5-10min。6八、二抗孵育根据一抗来源选择合适的二抗，根据鉴定方法选择HRP或AP标记的抗体，按相应比例稀释（1:1000~1:10000），抗体稀释方法同一抗。若背景重，则稀释大些。黏在rotat