中药复方雄黄-青黛治疗早幼粒细胞白血病分子机理的系统分析

复方雄黄－青黛治疗急性早幼粒性白血病分子机理的系统分析中医师依据临床经验，将多种植物或和矿物进行配伍形成处方，称为中药复方，以达到提高疗效，减少毒副作用的目的。有记载的中药复方将近十万个，但大部分复方的作用机制不明。为试图以现代生物医学的方法阐明中药复方的极有可能好处，以已被证实对治疗急性早幼粒细胞白血病（APL）有特效的复方雄黄-青黛(RIF)为研究对象进行研究。复方主要由雄黄、青黛、丹参三味中药构成，雄黄的活性成份是四硫化四砷（A），青黛的活性成份是靛玉红（I），丹参的活性成份是丹参酮IIA（T）。在小鼠APL的体内治疗及体外的细胞差异化诱导的疾病模型中，四硫化四砷、丹参酮IIA、靛玉红（ATI）3者联用能产生协同效应，可以显著增加癌蛋白PML-RARα的泛素化或降解，可以显著增加APL白血病细胞的分化；与单个或者2个成份组合相比，增强骨髓细胞再分化调节因子的活性，并促进细胞G0/G1阻滞。更有意思的是，丹参酮IIA和靛玉红可以上调水甘油通道蛋白9的基因表达活性，从而促进更多的砷进入恶性早幼粒细胞，这样就能显著增强砷引起的PML-RARα蛋白降解，提高疗效。数据也表明四硫化四砷是复方的主要成分，丹参酮IIA和靛玉红为辅助成分。建议从分子学，细胞学及组织学的角度对中药复方进行系统分析，不失为一种探索中药复方治疗机制的好途径。关键词：中医、活性成分、四硫化四砷、协同效应、系统生物学医学的复杂性表明，应小心设计治疗方案，每一张处方的构建都是对疾病进行战斗的艺术品。越来越多的证据显示，在治疗包括癌证和HIV/AIDS疾病时，治疗方案含有多个不同作用的药物但能相互放大各自疗效，达到最大疗效和最小毒副作用。有趣的是，中医使用复方药物治疗疾病已经有至少2500年的历史。典型的中药复方由几种草药或矿物药组成，其中一种为主要成分，其余作为佐剂起到增效作用或加速主药传递。据认为，至少在一些中药复方中，多组份具有激动多靶点，并发挥协同治疗作用。但是，绝大多数中药复方的化学成分没有鉴定，明确的分子机理有待阐明，阻碍了中药现代化的发展。急性早幼粒性白血病（APL）是急性髓系白血病（AML）中的M3型，特征是病人骨髓里积累大量的不成熟的早幼粒细胞以及出现特定的染色体易位t，导致大多数病人出PML-RARα融合基因。急性早幼粒性白血病癌细胞对分化诱导剂全反式维甲酸(ATRA)是敏感的，这种药物可以通过修饰和代谢癌蛋白PML-RARα使癌细胞重新分化。有意思的是，砒霜（三氧化二砷ATO）作为东西方传统医学中一种古老的药物，被证明是治疗APL的有效药物，其关键分子机理揭示与PML-RARα降解有关。最近有报道，ATRA/ATO的联合使用，可以使APL病人的4年生存率超过90％。在上个世纪80年代，在中国与其他国家的血液学和癌症专家努力阐释砒霜治疗APL分子机理，并将其与维甲酸结合，用于临床治疗该病的同时，完全根据中医理论，一支中国的中医队伍设计了一个治疗APL的中药方剂雄黄－青黛中药复方(简称RIF)，其“君药”是一种矿物药－雄黄，另有青黛、丹参和太子参作为佐剂发挥辅助作用。令人鼓舞的是，多中心临床试验表明，这个复方对APL病人的完全缓解率是96.7%到98％，5年生存率达到86.88%，病人除一定的肠胃不适和皮疹外，没有严重的毒副反应。雄黄和青黛配伍具有一定的抗APL活性。大量文献也表明丹参具有抗肿瘤活性。太子参被认为具有提高免疫力的作用，在RIF复方中可能不是必不可缺的成份。研究表明，雄黄的主要成份是四硫化四砷（A），青黛的有效成份是靛玉红（I），丹参的有效成份则是丹参酮IIA（T）。这些结果不只显示了RIF复方中这三种成份的临床效应，也表明了存在的可能协同作用，为进一步开发中药复方提供了保障。为了阐明中药复方设计的合理性，利用中药复方雄黄-青黛治疗急性早幼粒性白血病作为研究对象。四硫化四砷、靛玉红、丹参酮IIA分别是雄黄、青黛、丹参活性化合物，三种成分的配伍对急性早幼粒性白血病的治疗作用及机理经过体内和体外试验说明。结果ATI对体内小鼠APL模型的治疗效果注射1×105个能表达早幼粒白血病基因（PML-RARα）细胞对FVB/NJ小鼠进行造模。对比空白组和单独或者两两配对A，T和I治疗组，联合应用ATI能显著性延长其白血病老鼠总体生命存活率，如图1A所示。在单独治疗组中，A显示了潜在的治疗效果。联合应用ATI能够减少脾和肝的重量（图1B），但是不会导致动物体重的减少。在ATI治疗的老鼠骨髓和脾脏中以晚期分化粒细胞为主，但在其他治疗组却很少(图7)。与这个一致的结果是接受ATI治疗小鼠在骨髓和脾脏中表达粒细胞性分化抗原Gr-1和Mac-1的细胞明显比其他治疗组（图1c）。单独A或T治疗也引起一些APL细胞分化。不同于空白组，ATI治疗方案能显著减少癌症的转移和防止破坏组织架构（图8）。这些结果表明，ATI结合能够强化小鼠急性骨髓性白血病模型的治疗功效而且副作用较少。ATI对体外人类APL细胞分化的协同效果我们发现，除了T以外，单独的A或T治疗引起人类APL细胞系NB4以及原代培养的新鲜APL细胞一定程度细胞分化的形态特征，而ATI组合治疗不仅仅能够在这些细胞中诱导了更高层次的成熟分化，而且对耐NB4-R2ATR的ATRA细胞也是有效的（图2A）。与空白或单独或两两配对A和T治疗组相比较，ATI联合治疗对细胞显示出更高的活性，产生了由NBT还原法检测的氧化应激和CD11b/CD14蛋白表达上调（图2B和C）。为了测试A和/或T和/或I对APL细胞是否有协同或相加作用，使用中位数效应法分析单独或联合用药的剂量-效应曲线，其中组合指数（CI）小于，等于，和多于1分别表示协同，相加和拮抗作用。我们发现A，T和I在浓度范围为0.25至1.0μM的CI值1小于（图2D），说明药物之间具有协同效应。ATI缓解转录抑制转录因子，如CCAAT/增强结合蛋白（C/EBPs）和PU.1，对正常造血功能和粒细胞成熟起到关键作用。APL细胞中抑制了该转录因子。我们发现，用ATI联合处理NB4细胞时，给药第2天上调蛋白C/EBPα并随后下降，而下调了C/EBPβ1/2和C/EBPƐ蛋白（图3C和D）。进一步分析显示，单独使用A或T能调节这些蛋白质表达，而ATI的联合应用则增强效果（图3C）。原癌基因c-Myc阻断了髓样细胞分化，其表达下调是粒细胞分化的关键。有趣的是，与单独或两两配对（图3C和D）处理的细胞相比较，ATI处理组同时在蛋白质和mRNA水平的下调C-Myc。RARβ2是迄今在其启动子包含最强的天然RA响应元素的RAR靶基因。我们发现T和A均能在mRNA水平上调RARβ2，而ATI组合显著加剧的RARβ2上调（图3E）。利用ChIP分析，我们确定了RARβ2是从去乙酰化酶1中解离出来（HDAC1）（图3E下），这可能有助于RARβ2的转录激活。通过PML-RARα的显负效应抑制转录因子是参与APL发病机制，ATI联合治疗可能缓解APL细胞中对正常转录功能的压制，暗示了RIF在治疗APL的合理性。ATI诱发APL细胞中细胞周期主要的调节因子阻滞于G1/G0相我们测试了ATI治疗是否可以作用于细胞周期进程。发现T单独给药增加在G1/G0期的细胞区室，而AT，AI，以及TI的组合给药组进一步引起G1/G0期的阻滞（图4A）。有趣的是，在ATI处理组中，83.7％±6.7％NB4细胞停留在G1/G0期，显示了化合物对抑制G1/S期转换（图4A）的增强效果。在采用ATI（图4A）处理NB4-R2细胞中也观察到类似的结果。I是周期蛋白依赖性激酶（CDK2）抑制剂，这是对细胞周期从G1到S期至关重要。我们发现，A和I在NB4和NB4-R2细胞中下调CDK2的表达，而ATI的联合给药，进一步增强了这种效果（图4B）。CDK2已被证明能够磷酸化组蛋白H1（28），而从G1期向S期（29）过渡期间磷酸H1增加。含I的治疗方案明显降低H1的磷酸化（图4C）。P27是一种重要的CDK抑制剂，能负调节由G1进入S期。我们发现在用A，T，I，以及联合给药治疗NB4细胞中P27的蛋白质但不是mRNA显着增加（图3D和图4B）。ATI联合给药组也上调NB4-R2细胞的P27（图4B右）。通常情况下，Rb管辖细胞进入S期。我们发现在含有T（T，AT，TI和ATI）给药组中NB4细胞Rb蛋白表达略微升高，而ATI治疗组中显著上调了磷酸化Rb的表达（hypoPRB，在阻断细胞周期过程中作为肿瘤抑制因子Rb的功能形式）（图4B）。这些观察结果表明，A，T，和I有诱导APL细胞G0/G1期阻滞的协同/累加效应。通过上调水-甘油的跨膜输送的蛋白的表达（AQP9）T和I增加砷的细胞摄取已经有研究表明AQP9是砷化合物的跨膜转运蛋白。由此提出了一个问题：T和/或I会对A通过AQP9蛋白造成什么影响？为了解决这个问题，对NB4细胞用不同的方法处理4天，洗涤，然后用2.5μM的A孵育4小时。细胞内砷浓度（[AS]i）用原子吸收光谱仪系统进行测定。有趣的是，用ATI处理的细胞具有最高的砷浓度（[AS]i）。与A（图5A）处理组相比，AT和AI治疗组但不包括TI组，都具有较高的砷浓度，这表明T和/或I协助砷的吸收。已经报道MRP-1参与了砷的外排，并且最近AQP9已被证明是白血病细胞摄取砷和测定砷灵敏度的途径。我们发现经过这些化合物的处理NB4细胞中MRP-1的表达并没有改变（数据未示出）。有趣的是，ATI组给药24-96小时后能引起强烈AQP9的表达（图5B和C）。进一步的分析显示T，I，或I的类似物靛玉红-3'-肟（3m），与A联合给药后在mRNA（图5B）和/或蛋白质（图5C）的水平上能上调AQP9，而TI或T3m提高AQP9。免疫荧光法证实了联合给药T和I能上调AQP9的表达，而ATI的组合效果最明显（图5D）。为了验证AQP9在砷摄入的重要性，RNA干扰（RNAi）是用来抑制AQP9基因表达。该AQP9的siRNA表达载体导入NB4细胞的转染导致约二分之一AQP9的减少（图5E）。因此，在A，AT，AI或ATI的处理组合中AQP9抑制导致减少细胞内砷浓度的减少（图5F）。此外，由ATI诱导的AQP9抑制细胞成熟，如CD11b表达所揭示的（图5G）。这些结果表明，AQP9在砷运输过程中至关重要，通过上调AQP9T和I有利于摄取砷。讨论在过去的几年中，医药行业已经经历了从寻找针对某个单一致病分子的灵丹妙药到追求包括不止一种活性成分组合的联合疗法。有趣的是，中医在过去的2500年中一直主张组合治疗策略。根据患者的症状和特征以及中医理论的指导下，很多含有不同种类的植物或矿物的组合配方被配伍出来以提高临床疗效。复方黄黛制剂就是其中一个例子，它在近期被发现对急性早幼粒细胞白血病有很好的疗效。在本研究中，我们发现，在急性早幼粒细胞性白血病小鼠模型中，RIF活性组分（即A，T和I）的结合使用能显著延长载PML-RARα阳性白血病细胞小鼠的寿命。在细胞水平，ATI能诱导APL细胞在体内外的终末分化，并能克服全反式维甲酸耐药。通过中效评估法得到的CI值直接证明了A，T和I对NB4和NB4-R2细胞的协同作用。这些结果清楚地表明，RIF的组分形成了相互增强的效果。然而，ATI并未显示出对APL小鼠副作用的增强，这由体重变化能得到揭示，与临床上观察到的RIF的安全性是一致的。这些观察结果符合这个配方的合理性：增强组分的相互作用，减少不良反应。大量证据表明，PML-RARα是APL（急性早幼粒细胞性白血病）的致病癌蛋白。有趣的是，在小鼠APL模型中表现出最强治疗效果的A，也已经被证实是RIF靶向PML-RARα的主要组分。此外，T和I的结合增强了A诱导的泛素化和PML-RARα的退化，强化了A的作用。因此，虽然中医师在APL的前分子时代设计了RIF配方，但是现代生化分析也证明了它的合理性。此外，PML-RARα作为超越野生型RARα的一种显性负性突变体，阻止了髓样分化必需的关键靶向基因的活性。在这项研究中，ATI组合物被认