检出限和定量限的建立与验证EP17-A

检出限和定量限的建立与验证前言NCCLS制订的标准文件EP17-AProtocolsforDeterminationofLimitsofDetectionandLimitsofQuantitation;ApprovedGuideline内容四.结果报告二.空白限和检出限的建立与验证三.定量限的确认与验证一.名词解释五.小结一.名词解释空白限（limitofblank,LoB）：（一定概率下）空白样本可能被检测得到最高测量结果。•并非被测物的实际浓度；是确保阳性信号在实际浓度处成为检出限；检出限（limitofdetection,LoD）：检测系统或方法所能检测出的分析物的最低浓度。•分析灵敏度；检测底限；最小检出浓度定量限（limitofquantitation,LoQ）:一定实验条件下，在精密度和正确度可接受的情况下检测系统能够得到可靠结果的被测物最低浓度。三者关系：LoBLoD≤LoQ一.名词解释准确度（accuracy）：检测结果与可接受参考值之间的一致程度。•用偏离（deviation）也就是误差来衡量。正确度（trueness）：大量检测结果得到的均值与可接受参考值之间的一致程度。•用偏倚（bias）来表示，是一种系统误差。精密度（precision）:规定条件下独立测试结果之间的一致程度。•用变异系数（CV）和标准差（SD）来表示，是一种随机误差。总误差（totalerror,TE）:能影响分析准确度的确定误差的组合[EP15-A2]。•在EP17-A文件里用偏倚（bias）和不精密度来表示。二.空白限和检出限的建立与验证2.1简介多次检测空白样本和低浓度样本图1.空白样本和低浓度样本测定结果的分布图二.空白限和检出限的建立与验证2.1简介多次检测空白样本和假定低浓度样本图2.空白样本和假定低浓度样本（LoD）重复测定结果的分布图二.空白限和检出限的建立与验证2.2空白限和检出限的建立2.2.1空白限计算公式假设：高于第95百分位数的值被认为与空白检测存在明显区别，即被测物存在。第一类错误（αerror）：假阳性第二类错误（βerror）：假阴性一般默认，α=β=5%空白样本检测结果符合高斯分布（正态分布、对称分布），计算公式：LoB=µB+1.645σB（1）µB和σB分别表示空白检测的平均值和标准差。空白样本检测结果不符合高斯分布（非对称分布），计算公式：LoB=PctB100-α，PctB=NB(95/100)+0.5（2）NB分别表示检测次数；PctB（percentile）是第95百分位数，称为空白低限。二.空白限和检出限的建立与验证2.2.2检测限计算公式第二类错误（βerror）：假阴性一般默认，β=5%，即当样本浓度为LoD时其有95%的概率超过LoB。低浓度样本检测结果符合高斯分布（正态分布、对称分布），计算公式：LoDtent=LoB+cβSDS（6）cβ=1.645/(1-1/(4xf))cβ是标准正态分布第95百分位的单侧界值；fisthedegreesoffreedomoftheestimatedstandarddeviationSDS，检测次数-样本数。低浓度样本检测结果不符合高斯分布（非正态分布）若SDS是常数，计算公式：LoD=LoB+DS,β.（7）DS,β是中位数-第β位数；低浓度样本检测结果不符合高斯分布（非正态分布）而且SDS不是常数，则使用“试验-错误”程序，至β=5%位数值LoB（或者计算LoB的百分率，β≤5%）。LoD=LoB+1.645σS（4）二.空白限和检出限的建立与验证2.2.3实验设计检测分析系统：状态稳定（无试剂或校准物改变），单一分析系统或检测仪器，操作条件稳定（试剂批号不变）。但是建议考虑时间、批间、样本间及仪器的差异。样本数：建立，至少60次检测；验证，至少20次（建议多样本、多天、多次测定）。样本要求：实验样本应与实际样本具有互通性。例如，血清、血浆。[EP7,EP14]低浓度样本尽量来自临床样本。（空白样本和低浓度样本注意事项）检测结果：任何参数、性能、变量，定义明确。测定值应可溯源至国际单位（SI），或追溯至可知水平。二.空白限和检出限的确认与验证2.2.4空白限的建立（LoB）至少60次空白样本检测（一个或多个样本，建议多个样本）。空白样本检测结果符合高斯分布（正态分布、对称分布），计算公式：LoB=µB+1.645σB,（1）空白样本检测结果不符合高斯分布（非对称分布），计算公式：LoB=PctB100-α，PctB=NB(95/100)+0.5（2）厂家、方法开发者完成。二.空白限和检出限的确认与验证2.2.4空白限的建立（LoB）举例：正态分布--LoBLoB=µB+1.645σB（1）LoB=µB+cβSDSc95,116=1.645/(1-1/4*116)=1.649二.空白限和检出限的确认与验证2.2.4空白限的建立（LoB）举例：非正态分布--LoBLoB=PctB100-α，PctB=NB(95/100)+0.5二.空白限和检出限的确认与验证2.2.4空白限的建立（LoB）举例：非正态分布--LoBLoB=PctB100-α，PctB=NB(95/100)+0.5二.空白限和检出限的确认与验证2.2.5检出限的建立（LoD）至少60次低浓度样本检测（浓度范围LoB-4LoB，建议4-6个样本）。低浓度样本检测结果符合高斯分布（正态分布、对称分布），计算公式：LoDtent=LoB+cβSDS（6）cβ=1.645/(1-1/(4xf))低浓度样本检测结果不符合高斯分布（非正态分布）若SDS是常数，计算公式：LoD=LoB+DS,β.（7）低浓度样本检测结果不符合高斯分布（非正态分布）而且SDS不是常数，则使用“试验-错误”程序，至β=5%位数值LoB（或者计算LoB的百分率，β≤5%）。厂家、方法开发者完成。二.空白限和检出限的确认与验证2.2.5检出限的建立（LoD）举例：正态分布--LoDLoDtent=LoB+cβSDSLoDt=0.203+1.6449/(1-1/4*689)(0.117)=0.396μg/L二.空白限和检出限的确认与验证2.2.5检出限的建立（LoD）举例：非正态分布--LoD1）DS,β=0.170-resultinposition(Ns*β+0.5)=0.170-position(690x0.05+0.5)=0.170-position35二.空白限和检出限的确认与验证2.2.5检出限的建立（LoD）举例：非正态分布--LoD2）提高被测物水平，进行重复检测，至少20次。若符合高斯分布，LoDtent=LoB+cβSDS二.空白限和检出限的确认与验证2.3验证空白限和检出限2.3.1验证空白限（LoB）实验设计要求同之前基本一样。若厂家提供已知LoB，至少测定一个空白样本20次，测定结果大于LoB不超过3个，则验证通过。否则，单独建立LoB。若厂家不提供已知LoB，则单独建立LoB。实验室完成。二.空白限和检出限的确认与验证2.3.2验证检出限（LoD）先验证LoB；采用被测物量=LoD的样本，至少进行20次检测（建议多个样本、多天进行）。计算大于LoB的检测结果所占比例是否符合要求（默认β=5%），即≥95%。*若检测结果满足表2中的最低限，也被认为符合95%的要求。符合要求，验证通过。不符合要求，则联系厂家或单独建立LoD。Table2.Lower95%ConfidenceBoundsforObservedProportionsofResultsExceedingtheLoBWiththeExpectedProportion1-β=95%(modifiedfromLinnet&Kondratovich18)二.空白限和检出限的确认与验证2.3.3举例α=β=5%，LoD=45U/L；空白样本和浓度45U/L的样本分别检测25次（5天，各5个样本，每个检测5次）。PctB=25x0.95+0.5=24.25LoB=PctB100-α=18.01+0.25(22.65-18.01)=19.17大于LoB的检测结果所占比例23/25=92%85%验证通过。三.定量限的建立与验证3.1定量限的简介（LoQ）定量限（limitofquantitation,LoQ）:一定实验条件下，检测系统能够得到可靠结果的被测物最低浓度，其总误差符合实验室预期要求（临床可接受）。LoBLoD≤LoQ若低浓度样本的测量不确定度（uncertainty）或总误差（totalerror）能够确定，也可以不建立LoQ，直接提供低浓度样本的不确定度，由用户来决定测定值是否可用。总误差（totalerror，TE）的计算方法可参考文件EP21。样本要求：已准确定值。1）低浓度的标准物质或有证参考物质；2）在线性范围内稀释。厂家或方法开发者完成。三.定量限的建立与验证3.2定量限的建立（LoQ）总误差规定目标。样本数：建立，至少40次检测；验证，至少25次（建议多个样本多天、多次测定）根据LoD的测定结果的偏倚和不精密度，计算TE。计算SDS，若多个样本，按照下面公式计算：计算偏倚Bias=每个样本测定的均值-参考值总误差TE=｜Bias｜+2SDS。若LoD的总误差目标总误差，则LoQ=LoD。不满足则提高分析物浓度，按照上述步骤检测，重新计算TE，直至TE目标总误差。三.定量限的建立与验证3.3验证定量限（LoQ）采用被测物量=LoQ的样本，至少进行25次检测（建议多个样本、多天进行）。计算每个测定结果与参考值的偏差，比较是否偏差≤目标总误差（TE）计算小于TE的检测结果所占比例是否符合要求（默认β=5%），即≥95%。*若检测结果满足表2中的最低限，也被认为符合95%的要求。符合要求，验证通过。不符合要求，则联系厂家或单独建立LoQ。三.定量限的建立与验证3.4举例EP17-A：建立LoQ数据采用建立LoD时，非正态分布的数据，SDS=0.108。假设1：无偏倚（Bias）假设2：浓度0.5μg/L以下，目标TE=0.250μg/L计算：TE=｜Bias｜+2SDS=2x0.108=0.216μg/L0.250μg/L则LoQ=LoD.三.定量限的建立与验证3.4举例总误差目标20%。计算：0.500μg/LTE=｜Bias｜+2CV=（0.5-0.493）*100/0.5+2x9.3331=20.062%则LoQ=0.500μg/L.谭丽娜.酶联免疫法检测血清HBsAg的空白限、检出限及定量限的建立与评价[D].2013四.结果报告报告具体详细报告相对简单四.结果报告图5.空白样本、低浓度样本（LoD）和定量限处（LoQ）重复测定结果的分布图五.小结空白限的建立与验证（LoB）五.小结检出限的建立（LoD）五.小结检出限的验证（LoD）五.小结定量限的建立与验证（LoQ）Thankyou