细菌培养及菌体收集

基因工程实验流程参考图：细菌培养及菌体收集挑取单菌落于5ml2216E培养基中，8℃培养，100rpm转速，振荡120h后，12000rpm离心15min。弃去上清液，加入10mlTE洗涤离心后，用10mlTE溶解菌体，混匀，–20℃保存备用。实验一：菌株基因组DNA的提取（CTAB方法）CTAB/NaCL溶液配制：CTAB/NaCL溶液(10%CTAB，0.7MNaCL4.1gNaCL溶于80ml水中，缓慢加入10gCTAB，加热溶解)；原理：采用溶菌酶破碎细菌细胞壁，加入去污剂CTAB和EDTA消化细胞，可使核蛋白体解析，然后使蛋白和多糖杂质沉淀，DNA进入水相，再用酚、氯仿抽提纯化。最后得到DNA。细菌基因组DNA的提取细菌基因组DNA的电泳鉴定细菌基因组DNA的16srRNA片段PCR扩增PCR产物纯化E.coli感受态制备与pMD18-T载体的连接转化阳性克隆筛选碱变性法提取质粒DNA质粒DNA酶切验证阳性克隆送样测序序列比对以及系统发育树的建立确定菌株分类地位操作流程：取3.5ml菌悬液，加入184μl10%SDS，混匀，溶菌酶浓度为2mg/ml，37℃温育1h。加入740μl5MNaCl，再加入512μlCTAB/NaCl，混匀，65℃温育10min。加入等体积氯仿/异戊醇（24:1），混匀，10000rpm离心5min，吸取上清液。上清液中加入等体积苯酚∶氯仿∶异戊醇(25∶24∶1)，混匀，10000rpm离心5min，吸取上清液。加入0.6倍异丙醇，混匀，10000rpm离心5min，收集DNA沉淀，用70%乙醇洗涤DNA沉淀。用1mlTE溶解DNA，加入终浓度为20μg/mlRNaseA，4℃溶解过夜，–20℃保存。实验二：DNA电泳鉴定1．目的学会常用的DNA琼脂糖凝胶电泳、。2．原理DNA双螺旋分子骨架两侧带有含负电荷的磷酸根，在电场中会向正极方向移动。不同长度的DNA由于受到凝胶介质的阻力不同，表现为不同的迁移率而被分开。3．器材电泳仪，水平凝胶电泳槽和梳子及其制胶模块，250ml三角瓶，微波炉，台式离心机，旋涡混合器，凝胶成像系统，分光光度计，微量移液取样器，1.5ml离心管，双面微量离心管架，试管架等。4．试剂细菌基因组DNA，TAE电泳缓冲液，1000溴化乙锭储存液，电泳级琼脂糖粉，10加样缓冲液（或6加样缓冲液），DNA分子量标准（DNA/HindIII+EcoRI）。5．实验准备配制TAE电泳缓冲液（50储存液，pH约8.5：Tris碱242g，57.1ml冰乙酸，37.2gNa2EDTA.2H2O，ddwater定容至1L），1000溴化乙锭储存液（0.5mg/ml：50mg溴化乙锭溶于100mLddwater，4C避光储存），10加样缓冲液（20%Ficoll400，0.1mol/LNa2EDTApH8.0，1.0%SDS，0.25%溴酚蓝）；6加样缓冲液（0.25%溴酚蓝，40%蔗糖水溶液）；1.5ml离心管装入铝制饭盒（灭菌）、移液器吸头装入相应的吸头盒（灭菌）。6．操作步骤（1）称取0.5g琼脂糖粉，放入三角瓶，加入50mlTAE电泳缓冲液(1)，放入微波炉中烧开（1min）。50ml正好倒两块小胶。（2）注意观察烧瓶中的琼脂糖粉末，待完全熔化后停止微波炉（切不可让胶溶液溢出到微波炉中！）。（3）戴上线手套，从微波炉中取出三角瓶，置桌面上冷却致不烫手（约50-60C）。（4）把梳子插到凝胶灌制模具的正确位置后缓缓倒入胶溶液。胶溶液倒至与模具的矮边缘相平即可，不要把胶溶液溢到外面。在桌面上静置10-20分钟待胶完全凝固。（剩下的胶溶液封口后留待以后再熔化使用）。（5）在水平电泳槽中加满1TAE电泳缓冲液。根据电泳槽的长度把电泳仪的电压调至80V，注意正负电极的位置连接正确。（6）待胶完全凝固后（15-20分钟），小心拔出梳子。用手指捏住模具两侧的高边缘取出模具和凝胶放入电泳槽中间的平台上，凝胶要没入电泳液中。凝胶上有样品孔的一侧要朝向电泳槽的负极。（7）剪1片光面纸（或封口膜），点6l蒸馏水、1l10加样缓冲液，再加入3l质粒DNA溶液制成10lDNA样品。（8）在凝胶上选择相邻的加样孔。用10l的吸液头分别将管中的样品加入凝胶的加样孔中（如果需要时，在相邻的加样孔中加入1.5-3lDNA分子量标准物）。加样时持移液器的手以肘部固定在桌上，用另一只手扶住这只手的手腕，以减少移液器的抖动。看到蓝色的样品吸管尖头伸进加样孔后（不能伸得太深，以免穿破凝胶的底部）缓缓将蓝色的样品压入加样孔中。切不可使蓝色样品流到孔外。（9）打开电源开关，样品将形成一条蓝色的横带向前移动（如果发现蓝色向后移动，立即关闭电源，调换电极）。电泳将进行约30min。（10）当蓝色的溴酚蓝迁移到距凝胶边缘1cm时，关闭电源。取出模具和凝胶。（11）把凝胶小心反扣放入盛有EB的搪瓷盒中。放置约10分钟后，取出用自来冲洗两次。放入凝胶成像系统中拍照。（12）清理垃圾。染有EB的凝胶要放到专用的垃圾袋中作专门处理，以免污染环境。（13）撰写实验报告。7．思考（1）泳道中的质粒DNA有几条带？为什么？（2）溴酚蓝的迁移率相当于多少bp的DNA?（3）影响本实验结果的因素有哪些？实验三：PCR扩增1．目的学会PCR操作的基本技术。2．原理是将待扩增的DNA模板加热变性，与其两侧互补的寡聚核苷酸引物复性，然后经过耐热的DNA聚合酶延伸。再进入下一轮变性—复性—延伸的循环，n次循环后DNA可被扩增（1+X）n倍。其中25nt的引物退火温度Tm=2（A+T）+4（G+C）。3．器材旋涡混合器，微量移液取样器，移液器吸头，0.2mlPCR微量管，PCR仪，台式离心机，琼脂糖凝胶电泳系统。4．试剂5U/μlTaqDNA聚合酶，PCR缓冲液（10×，MgCl2free），25mMMgCl2，dNTP，引物，模板（细菌基因组DNA），无菌ddwater。5．实验准备dNTP混合液（每种25mM），TAE电泳缓冲液，1000溴化乙锭储存液（0.5mg/ml），10加样缓冲液，1.5ml离心管装入铝制饭盒（灭菌）、移液器吸头装入相应的吸头盒（灭菌）。合成的引物：16SrRNA基因PCR引物序列引物名称Primers对应于E.coli16SrRNA基因碱基位置Locationof16SrRNAgeneforE.coli引物序列PrimerssequencesGM3F8~275’-GGTTACCTTGTTACGACTT-3’GM4R1488~15075’-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3’待扩增的16srRNA片段长度：大约1500bp。6．操作步骤（1）在0.2mlPCR微量离心管中配制50μl反应体系。（以下加样量供参考，括号内是最终需要量，实验时需参照Taq酶说明书计算）PCR反应体系成分Component反应浓度Concentrations无菌双蒸水定容至25μl10×PCRBuffer1×PCRBuffer（2.5μl）MgCl225mM1.6μldNTP（各2.5μM）2.0μl引物1.0μl模板DNA0.5μlTaqDNA聚合酶0.2μl（2）根据厂商的操作手册设置PCR仪的循环程序：①94℃5min②94℃1min③50℃1min④72℃1min30s⑤goto②29times⑥72℃10min（3）PCR结束后，取10μl产物进行琼脂糖凝胶电泳。观察胶上是否有预计的主要产物带。（4）清理桌面，撰写实验报告。（5）PCR产物可以直接与T载体连接（见后面实验），然后转化感受态细胞。7．思考（1）复性温度如何确定？（2）为什么要在最后延伸10min？（3）是否有非特异性扩增产物（或引物二聚体），如何才能消除？实验四：PCR产物的纯化（从琼脂糖凝胶中回收DNA片断）1．目的学会从琼脂糖凝胶中回收DNA片断的基本技术。2．原理限制性内切酶切割后的DNA片断经过电泳后，按分子量大小被分开，排列在琼脂糖凝胶中，可以将特定的某条DNA带所在的凝胶切下来，加热或用特殊的试剂熔解凝胶，使DNA溶回到溶液中，再经过乙醇沉淀或过柱即可获得目的DNA酶切片断。3．器材旋涡混合器，微量移液取样器，移液器吸头，1.5ml微量离心管，双面微量离心管架，台式离心机，琼脂糖凝胶电泳系统，微波炉，水漂，恒温水浴。4．试剂电泳缓冲液，溴化乙锭溶液，电泳级琼脂糖粉，10加样缓冲液，DNA分子量标准，DNA凝胶回收试剂盒。5．实验准备配制TAE电泳缓冲液（10储存液），1000溴化乙锭储存液（0.5mg/ml），10加样缓冲液，1.5ml离心管装入铝制饭盒（灭菌）、移液器吸头装入相应的吸头盒（灭菌）；6．操作步骤（1）用1TAE配制1%琼脂糖凝胶。DNA用合适的酶切。（2）在胶上选定两个加样孔，分别加入少量（10μl）和大量（50μl）DNA酶切产物，电泳。（3）电泳结束后用刀片切下含有少量DNA酶切产物的泳道（一般选择位于凝胶的边缘），EB染色，在紫外灯下找到目的DNA带，用刀片切在带的下上下边缘各切一个小口作为标记。注意：含有大量DNA酶切产物的凝胶既不用EB染色，也不用紫外灯照射！（4）将做好标记的凝胶条与未染色的凝胶原位对齐，根据小胶条上的标记估计未染色的大胶上DNA酶切产物的位置，用刀片切下大胶中DNA产物所在的凝胶（尽量不要多余的凝胶），转移至一个称量过得干净的1.5ml微量离心管中。再称量后计算出胶的重量。（5）按照DNA凝胶回收试剂盒的说明书操作，回收DNA酶切产物：采用TaKaRaAgaroseGelDNAPurificationKitVer.2.0对琼脂糖凝胶中分离PCR产物进行纯化。具体操作步骤如下：1.使用TAE缓冲液或TBE缓冲液制作琼脂糖凝胶，然后对目的DNA进行琼脂糖凝胶电泳。2.在紫外灯下切出含有目的DNA的琼脂糖凝胶，用纸巾吸尽凝胶表面的液体。此时应注意尽量切除不含目的DNA部分的凝胶，尽量减小凝胶体积，提高DNA回收率。注）切胶时请注意不要将DNA长时间暴露于紫外灯下，以防止DNA损伤。3.切碎胶块。胶块切碎后可以加快操作步骤6的胶块融化时间，提高DNA的回收率。4.称量胶块重量，计算胶块体积。计算胶块体积时，以1mg=1l进行计算。5.向胶块中加入胶块融化液DR-IBuffer。DR-IBuffer的加量如下表：6.均匀混合后75℃加热融化胶块（低熔点琼脂糖凝胶只需在45℃加热)。此时应间断振荡混合，使胶块充分融化（约6～10分钟)。注）胶块一定要充分融化，否则将会严重影响DNA的回收率。7.向上述胶块融化液中加入DR-IBuffer量的1/2体积量的DR-IIBuffer，均匀混合。当分离小于400bp的DNA片段时，应在此溶液中再加入终浓度为20%的异丙醇。8.将试剂盒中的SpinColumn安置于CollectionTube上。9.将上述操作7的溶液转移至SpinColumn中，12,000rpm离心1分钟，弃滤液。注）如将滤液再加入SpinColumn中离心一次，可以提高DNA的回收率。10.将500l的RinseA加入SpinColumn中，12,000rpm离心30秒，弃滤液。11.将700l的RinseB加入SpinColumn中，12,000rpm离心30秒，弃滤液。12.重复操作步骤11。13.将SpinColumn安置于新的1.5ml的离心管上，在SpinColumn膜的中央处加入25l的灭菌蒸馏水或ElutionBuffer，室温静置1分钟。注）把灭菌蒸馏水或ElutionBuffer加热至60℃使用时有利于提高洗脱效率。14.12,000rpm离心1分钟洗脱DNA。实验五：T-A克隆：1．目的学会DNA片断的体外连接技术。2．原理：经TaqDNA聚合酶扩增后的PCR产物末端都带有单个A。正是基于这一原理，pMD18-T质粒经.EcoRV切成平端后，在开口端加上一个T制成T载体，一方面避免了自身环化，另一方面由.于T-A互