酶活力测定的原理和方法

酶的分析检测技术•酶促反应分析•酶活力测定方法•常见酶类的活力测定方法維持酵素活性緩衝液•緩衝液可維持溶液的恆定酸鹼度及離子濃度，兩者都會影響酵素的活性•經常在緩衝液中加入一些物質，以增加酵素安定或保持活性•溫度的影響•濃度的影響試劑的保存•避免潮解•分裝凍藏:切勿反復凍結-解凍。•甘油凍藏•避光防菌酵素失活的原因•可歸類成如下的物理性或化學性原因。•(1)蛋白質變性：•(2)酵素活性區破壞：•(3)蛋白脢水解：•(4)酵素抑制劑：酶反应速度曲线产物浓度时间斜率＝浓度/时间＝V酶反应速度可以通过单位时间内，单位体积中底物的减少量或产物的增加量来表示。酶反应速度和底物浓度的关系Vmax1/2VmaxV反应速度混合级反应零级反应一级反应[S]底物浓度Km米氏方程•v=Vmax[S]/(Km+[S])•Km为酶反应速度达到最大反应速度一半时的底物浓度，为酶的特征常数。•同一酶对不同底物Km不同。•Km最小的底物为该酶的最适底物。酶活力的测定•酶活力的测定就会是测定酶促反应速度。•必须测定酶反应的初速度。•底物浓度必须足够的大，至少为Km的10倍。•酶浓度必须适合。1、化学法•化学法是利用化学反应使产物变成一个可用某种物理方法测定的化合物。如根据比色、酸碱滴定、量热、量气法等来计算酶的活性。2、放射性化学法•经同位素标纪的底物在酶活力测定中有很重要的价值，用于标记的同位素一般有：•当同位素衰变时放出β射线（粒子）。•放射性化学法原理与化学法相似，但反应终止后，必须把放射标记的底物与产物分离，多用层析和电泳法，然后测定产物（或底物）的放射性，就可得知酶的活性。3、酶偶联法•有一些酶促反应的产物不易直接测定，需加入一指示酶转变成可测定的产物如测定葡萄糖氧化酶的反应速度：•β—D—葡萄糖+O2→葡萄糖酸内酯+H2O2此反应可用量气法或氧电极法测定，但通过一指示酶二过氧化物酶催化的反应测定吸收光谱的变化更为方便准确。•H2O2+色原（如愈创木脂）→H20+O2+染料测定酶活力•中止反应法或连续反应法进行•中止反应法•在恒温反应系统中进行酶促反应，间隔一定的时间，分几次取出一定容积的反应液，使酶即刻停止作用，然后分析产物的生成量或底物的消耗量。这是最古典的但仍是经常使用的方法，几乎所有的酶都可以根据这一原理，设计测定其活力的具体方法。酶反应的中止•使酶停止作用常使用强酸、强碱、三氯乙酸或过氯酸，亦可用SDS（十二烷基硫酸钠）使酶失活，或迅速加热使酶变性等。酶反应的底物或产物一般可用化学法，放射性化学法，酶偶联法进行测定。三、连续法测定酶活力•连续法测定酶活力，不需要取样中止反应，而是基于反应过程中光谱吸收，气体体积、酸碱度、温度、粘度等的变化用仪器跟踪监测反应进行的过程，记录结果，算出酶活性。连续法使用方便，一个样品可多次测定，且有利于动力学研究，但很多酶反应还不能用该法测定。1、一般的连续法•A光谱吸收法•该法主要指分光光度法和荧光法。分光光度法是利用反应物和产物在紫外和可见光部分光吸收不同，选择一适当的浓度，连续测定读出反应过程中光吸收的变化。该法适用于一些反应速度较快的酶。自动记录仪的普遍使用使该法更容易被人们接受。•脱氢酶以NAD+或NADP+或作为辅酶，反应中形成NADH或NADPH，340nm处可以观察到光吸收的变化。•NAD（P）H在340nm处吸收光后发射出460nm的光。因而，需这两个辅因子的任何反应都可用荧光法测定。B电化学法•很多不同类型的电化学法已用于酶反应测定中，最重要之一是电位计技术。其基本原理是溶液的电势取决于被测物的浓度和性质，采用这一原理制成的离子选择性电极，如pH电极可测定酶反应过程中反应液pH值的变化，从而得知参与反应的酶的活力。C量气法•在酶反应中底物或产物之一为气体时，可以通过测量反应系统中气相的体积或压力的改变，计算出气体释放或吸收的量。根据气体变化和时间的关系，即可求得酶反应速度。最常用的气体测量仪为瓦（勃）氏测压仪（Warburgmanometricapparatus）。用测压仪测定酶活力的优点是可以连续取得读数，以了解整个酶反应的过程，缺点是灵敏度低。准确程度都较光谱吸收法低。D量热法•由于在反应过程中有反应热的变化，用非常灵敏的量热计可以测定酶反应速度。该法灵敏，无干扰，且很通用，近年来逐渐引起了人们的重视。E旋光法•在某些酶催化的反应中，底物和产物的旋光有所不同，这时就可以根据旋光的变化来跟踪酶反应过程。在某些情况下，可通过形成络合物来提高旋光度。如乳酸与钼酸盐反应形成高比旋络合物，故可用旋光计跟踪LDH催化的乳酸和丙酸之间的转换。然而，在通常情况下，由于该法与其它方法相比灵敏度低，因而很少采用2、偶联的连续法•偶联的连续法就是将指示酶直接加到待测酶反应系统中，将其产物直接或间接转变成一个可用光谱吸收仪检测的化合物。连续的偶联反应必须在酶反应相同条件（pH，温度等）下进行，且加入的指示酶，以及其他各种物质不能干扰原来的酶活力。四、酶分析的自动化•所谓酶分析的自动化是指从加样，启动反应，检测、数据记录及结果处理等整个过程都由仪器自动操作。自动分析技术主要基于酶促反应的初速度原理，下面介绍两种方法。定时法•定时法是指在线性范围内，定时记录反应过程中读数的变化（如吸光度），由于这一变化值直接正比于初速度，故可分析出相应的物质浓度。•这种分析仪多用分光光度法检测或选用离子选择性电极，对大批量样品进行单一成分分析或对每一样品进行多因素分析，效率很高。固定化酶的活力测定•与水不溶性载体结合，在一定的空间范围内起催化作用的酶称为固定化酶。固定化酶的性质与游离酶有一些区别。所以固定化酶的活力测定与游离酶活力测定方法也有一些不同。常用的固定化酶活力测定方法介绍1.振荡测定：称取一定重量的固定化酶，放在一定形状，一定大小的容器中，加入一定量的底物溶液，在特定的条件下，一边振荡或搅拌，一边进行催化反应。经过一定时间，取出一定量的反应液进行测定。柱法测定：•将一定量的固定化酶装进具有恒温装置的反应柱中，让条件适宜的底物溶液，以一定的速率流过酶柱，收集流出的反应液。按常规方法测定底物的消耗量或产物的生成量。测定方法与游离酶反应液的测定方法相同。连续测定•利用连续分光光度法等方法可对固定化酶反应液进行连续测定，从而连续测定酶活力。测定时，可将振荡反应器中的反应液用泵连续引到连续测定仪（例如，双束紫外分光光度计等）的流动比色杯中进行连续分光测定。或者使固定化酶柱流出的反应液连续流经流动比色杯进行连续分光测定。一些酶常用活力测定方法•一、—淀粉酶的活力测定•—淀粉酶的测定方法很多，活力单位的定义差别很大。现介绍国内外常用的几种方法。•1、消色法：这是我国常用的—淀粉酶测定方法。在pH6.0，60℃条件下，每小时催化1g可溶性淀粉成为糊精的酶量为1个酶活力单位。•2、•3、MMU法：美国Miles公司采用的方法，以30min内催化可溶性淀粉生成1mg麦芽糖所需的酶量为1个酶活力单位（麦芽糖单位；MMU）二、糖化酶的活力测定•糖化酶活力测定都是以可溶性淀粉为底物在一定条件下进行反应，以单位时间内生成一定量的葡萄糖所需的酶量为酶的活力单位。但酶反应的条件各不相同，酶活力单位定义也有所差别。糖化酶的活力测定•次碘酸钠法•SP法•DU法•NPG法三、蛋白酶的活力测定•蛋白酶种类繁多，不同蛋白酶的性质和催化反应条件各不相同，无法规定一个统一的测定方法。目前使用最多的有福林—酚法、紫外光分光分度法和甲醛滴定法。•1、福林—酚法：蛋白酶催化蛋白质水解生成氨基酸。其中含酚基的氨基酸(酪氨酸、色氨酸等)与福林—酚试剂反应，生成蓝色复合物。蓝色深浅与含酚氨基酸的量成正比，从而测定其活力。•2、紫外光分光光度法：蛋白质或多肽水解后生成的含苯环氨基酸对275nm波长的紫外光具有最大的吸收值。利用蛋白酶催化酪蛋白水解前后在三氯醋酸可溶物中紫外线吸收值的变化，可测定酶活力的高低。•3、甲醛滴定法：用蛋白酶水解蛋白质生成氨基酸。再用甲醛固定氨基酸的氨基，用0.1NNaOH滴定生成的氨基酸的量，从而测定酶活力。•4、DHT—酪蛋白法：用5-氨基四唑重氮盐将酪蛋白中部分组氨酸和酷氨酸重氮化，得到黄色的重氮5-氨基四唑酪蛋白（DHT-酪蛋白）。以DHT-酪蛋白为底物，在蛋白酶作用下，水解生成DHT-肽。二价镍离子可与DHT-蛋白及DHT-肽形成稳定的可溶性红色螯合物，而锌离子可迅速沉淀DHT-酪蛋白，但不沉淀DHT-肽。选用合适浓度的锌离子和镍离子作为沉淀剂和显色剂，利用比色法可测定蛋白酶活力。四、脂肪酶的活力测定•脂肪酶在一定条件下，将甘油三酯水解，在不同水解阶段可放出脂肪酶、甘油二酯、甘油单酯及甘油。水解放出的脂肪酸可用标准碱液滴定。从而测定酶活力。五、葡萄糖异构酶的活力测定•以葡萄糖为底物，在酶的作用下异构化生成果糖，可用单位时间内葡萄糖的减少量或果糖的生成量来表示酶活力。•咔唑法：果糖与咔唑反应生成红色物质颜色深浅与果糖含量成正比，通过分光光度计测定，可测出果糖含量，进而计算酶活力。六、果胶酶的活力测定•果胶酶是一类水解果胶的酶的总称，包括果胶酯酶（PE）。聚半乳糖醛酸酶（PG）和聚半乳糖醛酸裂解酶（PGL）等多种。它们的作用方式和产物各不相同，无法找到一种方法适用于所有果胶酶的活力测定。经分离纯化后，可各采用不同的方法测定酶活力。对于混合的果胶酶，一般采用次碘钠法和粘度法测度。•次碘酸钠法：果胶酶水解果胶生成β-半乳糖醛酸，可用次碘酸钠法进行半乳糖醛酸的定量，从而测定果胶酶活力，对于分离纯化的外切聚半乳糖醛酸酶也采用本法测定活力。•粘度法：果胶被果胶酶水解后粘度下降。粘度下降至20～80%范围内时，与酶浓度成正比。七、碱性磷酸酶的活力测定•碱性磷酸酶在碱性条件下催化磷酸单脂水解生成无机磷酸，该酶的测定一般采用NPP法或定磷法。•1、NPP法：以对硝基酚磷酸（NPP）为底物，在酶作用下，NPP水解生成黄色的对硝基酚，可用分光光度计测定。•2、定磷法：以腺苷酸(AMP)为底物，按上述方法进行酶反应，生成的磷酸用钼兰定磷法测定650nm波长下的光密度变化，从而测定酶活力。八、葡萄糖氧化酶的活力测定•葡萄糖氧化酶催化葡萄糖氧化成葡萄糖酸和双氧水，产生的葡萄糖酸，用过量的氢氧化钠中和后，用盐酸反滴定，可得到葡萄糖酸的生成量，从而计算酶活力。九、胃蛋白酶的活力测定•每min能催化水解血红蛋白生成1μmL酪氨酸的酶量，为1个蛋白酶活力单位。•用分光光度法在275nm的波长处测吸收度十、胰蛋白酶的活力测定•测定时，取底物溶液3.0mL，加盐酸（0.001mol/L）0.2mL混匀，作为空白。取供试品溶液0.2mL与底物溶液（预热至25±0.5℃）3.0mL，立即计时并摇匀，使比色池内的温度保持在25±0.5℃，在253nm波长处，每隔30s读吸收度，共5min。以吸收度为纵坐标，时间为横坐标作图，取在3min内成直线部分的吸收度计算分析。其它常见酶的活力测定•细胞色素C的活力测定•L-天门冬酰胺酶的活力测定•溶菌酶的活力测定•超氧化物歧化酶（SOD）的活力测定•弹性蛋白酶的活力测定•脂肪酶活性测定•血清谷丙转氨酶（SGPT）测定（King氏法）•酯酶的活性测定